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Les puces à ADN

 

Les puces à ADN - Point scientifique

La mise au point de puces à ADN est née de la nécessité de visualiser les niveaux d'expression des gènes dans différentes populations cellulaires. Une puce à ADN est un support physique subdivisé en milliers de cases dans chacune desquelles on dépose une séquence d'ADN simple brin contenant un gènre particulier. On dispose sur cette lame des ADNc obtenus à partir des ARNm issus d'une cellule donnée, marqués par une molécule fluorescente. L'hybridation reflète alors les gènes exprimés dans une cellule donnée. De cette manière, on peut comparer les gènes exprimés dans différentes cellules (par exemple : cellules différenciées, cellules tumorales).

Le tableau ci-après présente un exemple de protocole dans le cas où l'on souhaite comparer le niveau d'expression d'un gène donné dans deux populations cellulaires différentes.

[Le protocole détaillé est consultable sur le site de l'ENS - "Plate-forme transcriptome" à l'adresse suivante : http://www.transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php]

Etapes
Modalités
1. Fabrication de la puce

Les fragments d'ADN dont on souhaite déterminer le niveau d'expression sont amplifiés par la technique de PCR puis déposés sur une lame préalablement recouverte de polylysine (cette substance assure la fixation de l'ADN via des interactions électrostatiques). Ces fragments d'ADN fixé à un support constituent des sondes. Ces puces sur lame de verre sont appelées microarrays. Les lieux de dépôts de l'ADN sur le support solide sont des spots.

L'ADN est dénaturé pour qu'il se trouve sous la forme simple brin sur la puce, ce qui lui permettra ultérieurement de s'associer au brin complémentaire contenu dans la cible.

voir le schéma de la puce

Remarque : Le terme " puces à ADN " est un terme générique. Il existe actuellement 2 procédés majeurs de fabrications de puces à ADN ce qui permet de distinguer différents types de puces : (1) les macro et microarrays avec un dépôt direct de molécules d'ADN déja synthétisées sur leur support (2) les puces à oligonucléotides avec la synthèse in situ ( sur la puce) des sondes oligonucléotidiques sur une surface solide. Avec les puces à oligonucléotides on peut synthètiser jusqu'à 300000 oligonucléotides représentant 30 000 gènes sur une puce d'une surface d'environ 1 cm2

2. Préparation de la cible

( = préparation de l' ADN des cellules dont on souhaite étudier l'expression)

Des ARN sont extraits de différents types de cellules (notés arbitrairement ici cellules 1 et cellules 2) pour lesquelles on veut comparer le niveau d'expression du gène étudié (c'est-à-dire celui qu'on a fixé sur la puce ). Les ARN messagers permettent d'obtenir des ADNc par transcription inverse.

Les ADNc sont ensuite marqués de manière différente : par exemple, l'ADN des cellules 1 est marqué avec un fluorochrome vert, tandis que l'ADN des cellules 2 est marqué avec un fluorochrome rouge.

3. Hybridation de la cible et de la sonde

Les ADN marqués en vert et ceux marqués en rouges sont mélangés (cet ensemble constitue la cible) puis déposés sur la sonde. La puce est alors incubée une nuit à 60 degrés : à cette température, un brin d'ADN s'apparie avec son complémentaire ce qui forme de l'ADN double brin. Les ADN fluorescents vont ainsi s'hybrider sur les gènes qui avaient été déposés sur la sonde.

voir le schéma de la préparation de la cible et de son hybridation avec la sonde

4. Lecture brute des données

Chaque spot (c'est-à-dire chaque emplacement sur la puce) est excité par un laser et on enregistre la fluorescence émise d'une part dans le rouge , d'autre part dans le vert. On obtient alors deux images dont le niveau de gris représente l'intensité de la fluorescence lue. En remplaçant les niveaux de gris par des niveaux de vert pour la première image et des niveaux de rouge pour la seconde, on obtient en les superposant une image en fausses couleurs composée de spots allant du vert (cas où seulement de l'ADN des cellules 1 s'est fixé à la sonde ) au rouge (cas où seulement de l'ADN des cellules 2 s'est fixé à la sonde) en passant par le jaune (cas où l'ADN des deux types de cellules s'est fixé en quantité égale).

voir un exemple de résultat brut

4. Traitement des données

Il s'agit, à partir des deux images de la puce, de calculer le nombre de molécules d'ADNc qui se sont hybridées avec les molécules d'ADN de la sonde. Pour cela, on mesure l'intensité du signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome vert et l'intensité du signal dans la longueur d'onde d'émission du fluorochrome rouge. Puis on normalise ces quantités en fonction de divers paramètres (quantité de cellules au départ , puissance d'émission de chaque fluorochrome, ...). On suppose que la quantité d'ADNc fluorescent fixée est proportionnelle à la quantité d'ARNm correspondant dans la cellule de départ et on calcule le rapport fluorescence rouge / fluorescence verte. Si ce rapport est supérieur à 1 , cela signifie que le gène étudié est plus exprimé dans les cellules 2 ; si ce rapport est inférieur à 1, cela signifie que le gène est moins exprimé dans les cellules 2. On peut visualiser les différences d'expression d'un gène donné ou bien comparer les niveaux d'expression de différents gènes grâce à des logiciels appropriés.

voir un exemple de données obtenues avec différents gènes et traitées avec le logiciel Arrayplot