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Caractérisation et différenciation des cellules souches hématopoà¯tiques Caractérisation des cellules de la moelle osseuse Les cellules souches adultes sont des cellules rares que l'on peut observer dans différents tissus (Moelle osseuse, foie, muscles, pancréas...). La moelle osseuse est un tissu facilement accessible au sein duquel on peut trouver les cellules souches hématopoà¯tiques Caractérisation microscopique L'observation microscopique d'un frottis de moelle osseuse permet de déterminer la présence de différentes cellules différenciées.Frottis de moelle osseuse<élémentDeListe>Mégacaryocytes Mégacaryocyte Les mégacaryocytes sont des cellules peu nombreuses quel'on peut repérer facilement à  faible grossissement grà¢ce à  leurgrande taille. Ils présentent le plus souvent un noyau bilobé. Ce sontde grosses cellules (30 à  40 microns) assez rares dans la moelleosseuse (moins de 0.1% de la population cellulaire) <élémentDeListe>Les granulocytes ou polynucléaires MyelocyteOn peut observer dans la moelle les différents stades dela lignée myoloà¯de, du myeloblaste au granulocyte en passant par lesmyelocytes de différents stades. La différenciation est marquée par l'apparition d'une granulation progressive. <élémentDeListe>Les érythroblastes ErythroblastesOn peut observer dans la moelle osseuse les différentsstades de la lignée "rouge" ou érythroà¯de. Du proérythroblaste à l'erythrocyte en passant par le reticulocyte qui expulsera le noyaupicnotique, on observe une diminution de la taille dunoyau. <élémentDeListe>Les lymphocytes et monocytes Lymphocytes La caractérisation des cellules souches hématopoà¯étiques nécessite une observation préalable des différentes populations cellulaires présentes dans la moelle osseuse. Cette caractérisation ne peut se faire totalement sur des crità¨res structuraux, elle nécessite une analyse des marqueurs cellulaires. Ces marqueurs de différenciation cellulaire associés à  différents fluorochromes peuvent àªtre repérés et analysés par cytofluorométrie. La présentation sous forme de dot plot des données de cytofluorométrie permet une double caractérisation des cellules analysées. Schéma AP Double caractérisation Les paramà¨tres FSC (Forward scatter) et SSC (Side scatter) donnent des indications sur la taille et la granulosité des cellules. Scéma AP Taille et granulosité Caractérisation cytométrique Les analyses ont été réalisées sur de la moelle osseuse humaine incubée avec différents marqueurs associés à  différents fluorochromes. L'analyse des données permet de spécifier chaque population cellulaire. Les lymphocytes T Les lymphocytes T sont subdivisés en des sous-populations: Les lymphocytes T sont subdivisés en des sous-populations: Schéma AP Caractérisation des Lymphocytes T Les lymphocytes B, les granulocytes et les monocytes Les lymphocytes B présentent à  leur surface le marqueur de différenciation CD19. Les ganulocytes et les monocytes partagent quant à  eux le marqueur de différenciation CD11b. Schéma AP Caractérisation des Lymphocytes B, des granulocytes et desmonocytes Les érythroblastes Les érythroblastes sont caractérisés par la glycophorine A (GPA). Schéma AP Caractérisation des érythroblastes Les cellules souches dans les cellules de la moelle osseuse La caractérisation des cellules souches dans la moelle osseuse se fait en isolant tout d'abord les cellules indifférenciées (CD34+) puis parmi cette population cellulaires , on isole les CD38- représentant les cellules souches. La proportion de cellules indifférenciées parmi les cellules de moelle osseuse est de 2.3%. La proportion de cellules souches parmi les cellules indifférenciées de la moelle osseuse est de 10%. Schéma AP Caractérisation des cellules souches dans la population des cellules de la moelle osseus Différenciation lymphocytaire des cellules de sang de cordon en culture sur cellules stromales. Différenciation des lymphocytes B Les cellules issues du sang de cordon humain sont mis en culture sur des cellules stromales murines. Des prélà¨vement sont réalisés à  différentes étapes de la différenciation lymphocytaire. Les marqueurs cellulaires caractérisés (CD79a marqueur précoce de la différenciation et CD19 marqueur final de différenciation) permettent de suivre cette différenciation dans le temps. Pour chaque fichier de données cytométriques on a marqué <élémentDeListe>CD10-RD1 <élémentDeListe>CD79a-PC5 <élémentDeListe>CD19-APC Schéma AP Différenciation des Lymphocytes BProtocole expérimental Schéma AP Protocole d'analyse de la différenciation lymphoà¯de B Résultats expérimentaux Différenciation des cellules NK Protocole expérimental Schéma AP Protocole d'analyse de la différenciation NK Les résultats On obtient <élémentDeListe> 13% de cellules CD56+ aprà¨s 12 jours dans les conditions B <élémentDeListe> 5% de cellules CD56+ aprà¨s 12 jours dans les conditions A Schéma AP Expression du marqueur CD56 dans les conditions expérimentales A Schéma AP Expression du marqueur CD56 dans les conditions expérimentales B Analyse La présence de la proteine NOTCH au contact des cellules du sang de cordon favorise la différenciation NK.