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Histoire d'une découverte

Rédigé par Jacques Barrère d'après Alain Bernot et Olivier Alibert, 
Généthon 1997

L'expérience de Griffith


Le premier phénomène qui allait permettre de progresser dans l'identification du support de l'hérédité est celui de la transformation bactérienne, rapporté en 1928 par l'anglais Fred Griffith (1877 - 1941). Celui-ci travaille alors au laboratoire de pathologie du ministère de la santé du Royaume Uni.
Griffith décrit deux souches de pneumocoques Diplococcus pneumomiae : la souche R (rough, car lorsque cette souche est cultivée sur milieu de culture artificiel, les colonies obtenues ont un aspect rugueux) et la souche S (smooth, car les colonies ont au contraire un aspect lisse). La souche S doit son aspect à une capsule polysaccharidique qu'elle synthétise autour d'elle. Cette souche est mortelle pour la souris lorsqu'elle lui est injectée. A l'inverse, la souche R ne synthétise pas une telle capsule, et elle n'est pas nocive lorsqu'elle est injectée à une souris. On sait aujourd'hui que cette différence entre les deux souches est due à une mutation, chez la bactérie R, du gène codant l'enzyme responsable de la synthèse de la capsule.
Griffith observe tout d'abord que l'injection de bactéries S, si elles ont été préalablement tuées par la chaleur, n'est plus létale pour la souris. Pour une raison qui nous est toujours inconnue, Griffith décide alors d'injecter conjointement des bactéries S chauffées mélangées à des bactéries R vivantes. Cette fois, les souris meurent de septicémie. Les bactéries R, au contact des bactéries S tuées, ont donc acquis un caractère pathogène qu'elles ne possédaient pas précédemment. Ce phénomène a été appelé transformation bactérienne, et il a été par la suite reproduit chez plusieurs autres espèces bactériennes.
Il existe en fait plusieurs souches de pneumocoques (types I, II, ou III), discernables grâce à des tests 
immunologiques. Lorsque qu'une souche R de type III est injectée avec une souche S de type II inactivée, la bactérie virulente qui est ré-isolée de la souris tuée est toujours du type II. Ce changement est stable et définitif.
Ceci suggère donc qu'il existe chez les cellules un "facteur transformant", probablement libéré par la chaleur, susceptible d'être intégré par d'autres bactéries, et qui leur confère de façon héréditaire de nouvelles propriétés génétiques.
Ce phénomène représentait un test d'activité biologique, grâce auquel on pouvait envisager de déterminer la nature du matériel génétique responsable de la transformation de bactérie du type R en bactérie de type S. Griffith ne sut pas en tirer lui-même avantage, et la nature du "facteur transformant" sera élucidée plus de 10 ans plus tard par Avery et ses collègues.
La nature biochimique du matériel génétique mis en évidence par Griffith est élucidée en 1944 par les travaux de Oswald Avery, et de ses collègues (Colin McLeod, et McLyn McCarthy), qu'ils mènent à l'Institut Rockfeller de New-York. Ils reprennent les expériences de Griffith sur la transformation bactérienne, et cherchent à purifier le facteur transformant du pneumocoque.
Cette caractérisation prendra 10 ans, elle les conduit à montrer que ce facteur n'est autre que l'ADN : en effet, l'ADN extrait d'une souche S suffit à lui seul pour transformer une souche non virulente en souche virulente. La transformation des bactéries R s'effectue par incorporation de fragments d'ADN provenant des bactéries S tuées. On sait aujourd'hui que de tels fragments sont capables de rentrer dans une bactérie vivante, et de s'intégrer au chromosome de celle-ci en lieu et place de la région homologue.
L'identification de l'ADN comme principe transformant est à l'époque suffisamment extraordinaire pour 
nécessiter qu'une telle découverte soit étayée par des arguments indiscutables. Aussi Avery et ses collègues effectuent-ils leurs analyses avec un soin particulièrement méticuleux. Tous les contrôles alors disponibles sont testés : l'absence de protéine dans les préparations est testée par divers réactifs chimiques, leur composition chimique est analysée par des moyens chimiques ou spectrophotométrique. Enfin, l'utilisation d'enzymes montre que le pouvoir transformant réside bien dans l'ADN, puisque la DNAse anéantit ce pouvoir, alors que la RNAse ou des protéinases le laisse intact.


Référence
Avery, O.T., McLeod, C.M. & McCarthy M. (1944) Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus Type III J. Exp. Med. 79, 137-158.

La difficulté à accepter l'ADN comme support de l'hérédité


Malgré une accumulation croissante de preuves jusqu'au début des années 50, la communauté scientifique n'a pas accepté facilement que l'ADN puisse être le support de l'hérédité. Selon les thèses alors les plus largement acceptées, l'ADN n'est qu'une molécule simple, et donc incapable de véhiculer une information  complexe. La théorie tétranucléotidique proposée par Phoebus Aaron Levene (1869 - 1940), stipulait que la structure de l'ADN est régulière et monotone, comprenant un enchaînement répétitif des 4 bases azotées. 
Levene était alors un des plus grands spécialistes des acides nucléiques, c'est lui qui avait identifié le 
désoxyribose comme un des constituants de l'ADN. Les protéines, dont on avait perçut l'immense diversité, semblaient de bien meilleurs candidats pour véhiculer une information génétique.
La découverte de Avery a été accueillie avec beaucoup de scepticisme, ils furent interprétés par beaucoup comme le résultat d'une contamination des préparations d'ADN par de faible quantité de protéines ou d'une autre substance. Et même si ces préparations d'ADN étaient absolument pures, il était possible d'envisager que cette molécule ne soit pas elle même porteuse d'information, mais qu'elle joue simplement un rôle de commutateur : toutes les informations nécessaire à la transition de la forme R vers la forme S auraient déjà été présentes dans chacune des souches, et l'ADN n'aurait alors contribué qu'à la transition d'un type vers l'autre.
Avery lui-même n'a pas véritablement cherché à imposer ses conclusions. Ainsi, l'importance fondamentale de ces travaux ne sera reconnue que tardivement, et le comité Nobel ne le retiendra pas pour l'attribution d'un prix. Lorqu'en 1953 Watson et Crick décriront la structure de l'ADN, ils ne prendront même pas la peine de citer ces travaux dans leur article.
Certains scientifiques ont cependant saisis immédiatement la portée immense des travaux d'Avery. Ce fut en particulier le cas de E. Chargaff, J. Lederberg, G. Beadle, ou de A. Lwoff.
Chargaff est un biochimiste d'origine autrichienne ayant émigré aux USA en 1934. Il fait partie des 
scientifiques qui saisissent immédiatement la portée immense des travaux d' Avery sur la transformation 
bactérienne. Lorsque Avery publie ses résultats, Chargaff dirige un laboratoire de biochimie à l'université de Columbia. Le thème central en est alors la biochimie des lipoprotéines. Quand il prend connaissance des travaux d'Avery, Chargaff comprend aussitôt que l'ADN occupe une place centrale dans les mécanismes héréditaires, et il décide de consacrer désormais les activités de son laboratoire à l'étude des acides nucléiques.
En 1950, il publie ses travaux sur le contenu en bases azotées de l'ADN chez diverses espèces, réalisés grâce aux progrès de la chromatographie sur papier. Il montre alors que le rapport A+T/C+G est variable selon les espèces, mais constant pour tous les membres d'une espèce donnée. L'ADN est donc porteur d'une certaine spécificité, cette molécule n'a pas une structure polymérique monotone, elle est donc susceptible de contenir une information. Ces travaux contribuent à répandre l'idée que l'ADN puisse être une molécule porteuse de l'information génétique.
Chargaff montre par ailleurs que le rapport C/G ou A/T est à l'inverse constant et quasiment égal à un chez toutes les espèces étudiées. Cette dernière observation sera déterminante pour l'élaboration du modèle de la structure de l'ADN par Watson et Crick quelques années plus tard.
A la suite du succès remporté par ce modèle, Chargaff est très réticent à en reconnaître l'entière paternité à ses auteurs, pour lesquels il n'a jamais eu grande estime (à la suite de sa première rencontre avec Watson et Crick, il les avait comparés à deux clowns). Il continuera à revendiquer pour son propre compte le modèle d'appariement des bases, alors qu'il n'y avait lui même jamais pensé, et n'ayant mis en évidence que les rapports égaux d'adénine et de thymine, de cytosine et de guanine.


Références
Chargaff, E. (1950) Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their enzymatic degradation. Experientia 6, 201.
http://www.nobel.se


Al Hershey est, avec Delbrück et Luria, la troisième personnalité marquante du Groupe du phage. Sa première contribution importante est la mise en évidence d'une génétique des bactériophages : Il montre en effet en 1946 que peuvent apparaître des mutations chez ces organismes, caractérisés par différentes formes de plages de lyse. Ces résultats confirment donc ceux obtenus par Luria l'année précédente.
Hershey parvient aussi à détecter des phénomènes de recombinaison chez les phages : en infectant 
simultanément une souche bactérienne avec deux phages portant des mutations distinctes, il observe 
l'apparition de phages recombinants, portant soit simultanément les deux mutations, soit aucune d'entre elles. Des observations similaires seront rapportées par Delbrück.
Mais l'expérience la plus célèbre de Hershey concerne l'étude du rôle que jouent chacun des constituants du phage (ADN et protéines) dans la transmission de l'information génétique. Pour cela, il utilise - avec Martha Chase - le bactériophage T2. Leur expérience est une des premières expériences de biologie moléculaire où des isotopes radioactifs permettent de tracer des molécules. Ils utilisent un marquage isotopique différentiel de chacun des constituants du phage : du phosphore radioactif, incorporé à l'ADN, et du soufre radioactif, incorporé aux protéines de la capside. Ces phages sont utilisés pour infecter des bactéries. Immédiatement après l'infection, il est possible de séparer par agitation mécanique les bactéries des phages qui les ont infectés, et de séparer par centrifugation les particules phagiques des bactéries infectées. Lorsqu'elles sont remises en culture, ces bactéries produisent des phages. Or l'analyse de la répartition de la radioactivité montre que ces bactéries ne contiennent que du phosphore radioactif : seul l'ADN a donc pénétré dans la cellule, et cette fraction est responsable à elle seule de la reproduction du phage. C'est donc l'ADN qui détient l'information génétique.
Bien que cette expérience était dans sa conception plus grossière que celle d'Avery, son impact fut au moins aussi important. Ceci était dû en partie au fait qu'elle avait été effectuée par des membres du Groupe du phage, qui représentait alors les scientifiques les plus influents dans le domaine de la biologie moléculaire. D'autre part, ces résultats arrivaient pratiquement simultanément avec l'élucidation de la structure de l'ADN par Watson et Crick.


Références
Hershey, A.D. (1946) Spontaneous mutations in bacterial viruses. Cold Spring Harbor Symposia on 
Quantitative Biology XI, 33-37.


Hershey, A.D. (1946) Mutations of bacteriophage with respect to type of plaque. Genetics 31, 620-640.`


Hershey, A.D. & Chase, M. (1952) Independant functions of viral proteins and nucleic aced in growth of 
bacteriophage. J. Gen. Physiol. 36, 39-56.

La structure de l'ADN: L'élaboration du modèle par Watson et Crick


La structure en double hélice de l'ADN est élucidée par Watson et Crick en 1953. Watson a décrit dans son livre passionnant La double hélice (1968) le récit de la formidable découverte réalisée avec Crick . Les deux chercheurs disposent alors des éléments suivants : (i) la composition chimique de l'ADN (désoxyribose, bases azotées, et groupements phosphate) ; (ii) les clichés de diffraction aux rayons X d'ADN cristallisé, clichés dus principalement à Rosalind Franklin et Maurice Wilkins du King's College. Ces clichés montrent une figure en croix, caractéristique des structures en hélice ; (iii) les travaux de Erwin Chargaff, qui avaient montré que pour toute molécule d'ADN, le nombre de molécules d'adénine est égal au nombre de molécules de thymine, et que celui de cytosine est égal à celui de guanine ; (iv) les analyses en microscopie électronique, qui avaient montré que le diamètre de la molécule d'ADN est de 20 Å, ce qui suggérait que cette molécule comportait deux chaînes de désoxyribose-phosphate.
C'est en élaborant successivement plusieurs modèles moléculaires que Watson et Crick réussissent à 
proposer une structure qui satisfasse à l'ensemble des données cristallographiques et biochimiques alors disponibles. Cette structure est aujourd'hui connue de tous, elle est devenue l'emblème de la biologie moléculaire : deux brins constitués des groupements phosphates et des sucres forment une double hélice où les orientations de chacun des brins sont opposées. Sur les sucres de chacun des deux brins sont liées les bases azotées, chaque base d'un brin étant maintenue en vis-à-vis d'une base de l'autre brin par des liaisons hydrogène. Une cytosine fait toujours face à une guanine, et une adénine à une thymine. Les deux brins d'une molécule d'ADN sont dits complémentaires.
Crick, Watson, et Wilkins reçurent en 1962 le prix Nobel pour ces travaux, qui a été qualifiée par Peter Medawar de "la plus grande réussite scientifique de notre siècle". Rosalind Franklin aurait vraisemblablement été associée à ce prix si la maladie ne l'avait prématurément emportée.


La molécule sémantique
L'ordre des bases le long de la molécule définit l'information génétique portée par l'ADN. Les possibilités offertes par l'agencement des quatre bases de l'ADN sont immenses (4n pour une séquence de n bases, soit par exemple plus d'un milliard de combinaisons pour une séquence de 10 bases).
L'ordre des bases nucléotidiques détermine l'enchaînement des acides aminés des protéines (par 
l'intermédiaire des processus de transcription et de traduction). Une structure à une dimension détermine donc des structures à 3 dimensions. Ce paradoxal "gain d'information" est réalisé spontanément, par le reploiement des protéines au fur et à mesure de leur synthèse, en fonction des contraintes thermodynamiques imposées par leur séquence et par le milieu dans lequel elles sont synthétisées.
Les êtres vivants disposent donc d'un système informatif à une dimension, entièrement compris dans une séquence linéaire, qui peut être facilement copié ou dupliqué. De cette séquence linéaire découle celle des protéines, qui adoptent spontanément la structure à trois dimensions nécessaire à leur fonction.


La réplication
La propriété auto-réplicative des gènes constituait un phénomène mystérieux, qui avait suscité de nombreuses théories explicatives. Celle qui s'approchait le plus de la réalité fut sans doute proposée par Pauling et Delbrück en 1940 : probablement, une telle opération pouvait s'effectuer par l'intermédiaire d'une structure intermédiaire, un moule en négatif, dont le moulage produira à son tour une structure identique à l'original.
Dans la publication de leur modèle, Watson et Crick mentionnent : "il n'a pas échappé à notre attention que l'appariement spécifique des bases que nous avons proposé suggère immédiatement un mécanisme possible de réplication pour le matériel génétique". Cet appariement suggère en effet le mécanisme par lequel chacun des brins complémentaires de l'ADN peut être à la fois matrice et participant pour la constitution de deux nouvelles molécules d'ADN : après séparation des deux brins, chacun d'eux est utilisé comme matrice pour la synthèse du brin complémentaire, ce qui aboutit à la formation de deux molécules identiques entre elles et identiques à la molécule initiale.
 


Jim Watson est né à Chicago le 6 avril 1928. Trés précoce, il entre à l'université de Chicago à l'âge de 15 ans. Il prépare sa thèse entre 1948 et 1950 dans le laboratoire de Salvador Luria, dont il est le premier étudiant. Il est donc bien informé des travaux menés par le groupe du phage. Il effectue une courte période post-doctorale au Danemark, avant de rejoindre en 1951 Francis Crick à Cambridge au laboratoire Cavendish (dirigé par Max Perutz et Lawrence Bragg). En 1953, Crick et Watson élucident la structure en double hélice de l'ADN . A partir de 1953, Watson est Senior Research Fellow au Californian Institute of Technology , jusqu'en 1956, où il devient professeur à l'université de Harvard.
En 1962, le prix Nobel de physiologie et de médecine est attribué à James Watson, Francis Crick et Maurice Wilkins, pour "leur découverte concernant la structure moléculaire des acides nucléiques et son importance concernant le transfert d'information dans les systèmes vivants". La même année est attribué le prix Nobel de chimie à Max Perutz et John Cowdery Kendrew pour "leurs études de la structure des protéines globulaires". Ces deux prix couronnent l'application de la diffraction des rayons X à la détermination de structures de molécules biologiques.
En 1968, Watson prend la direction du Cold Spring Harbor Laboratory , où il développe en particulier la recherche sur les bases moléculaires du cancer. Il dirige alors parallèlement deux laboratoires (l'un à Harvard, l'autre à CSH), jusqu'en 1977 où il renoncera à celui d'Harvard. En 1988, dans le cadre du Projet Génome Humain , lui est confiée la direction du programme Génome Humain du National Institutes of Health (qui allait devenir l'année suivante le NCHGR : National Center for Human Genome Research of the National Institutes of Health). Il en démissionne en 1992, lorsque le NIH manifeste la volonté de prendre des brevets sur des séquences partielles de cDNA humains. Il est actuellement président du CSHL.


Références
Watson, J.D. & Crick, F.H.C. (1953) A structure for desoxyribose nucleic acid. Nature 171, 737-738. 
Watson, J.D. & Crick, F.H.C. (1953) Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature 171, 964-967. 
Watson J.D. (1968) La double hélice, Hachette/Pluriel. 
Recombinant DNA, (1992) Watson, J.D., Gilman, M., Witkowski, J. & Zoller, M. Scientific American Books. 
Molecular biology of the cell, (1994) Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Watson, J.D. Ed.Garland Publishing.


Francis Crick est physicien de formation. Il travaille tout d'abord à l'University College de Londres, sur la viscosité de l'eau à haute pression et haute température. Pendant la guerre, il est embauché par l'Amirauté pour la mise au point et la détection de mines magnétiques. Une fois la guerre finie, il s'oriente vers la cristallographie, au sein du laboratoire Cavendish, dirigé par Max Perutz et Lawrence Bragg. C'est là que le rejoint Jim Watson en 1951. Crick a alors 35 ans, et il prépare toujours sa thèse. Watson et Crick se consacrent alors à la structure de l'ADN, pour laquelle ils proposent un modèle en 1953. Ces travaux seront couronnés par un prix Nobel attribué en 1962.
Par la suite, toujours au laboratoire Cavendish, Crick s'attache avec Sidney Brenner au déchiffrage du code génétique. Après que ce code est élucidé en 1966, Crick se tourne vers la biologie du développement. Enfin, en 1976, Crick rejoint le Salk Institute for Biological Studies, près de San Diego, où il se consacre à la neurobiologie.
Crick a apporté d'importantes contributions à plusieurs domaines de la biologie moléculaire : c'est à lui que l'on doit le dogme central de la biologie, qui stipule que le flux d'information depuis les acides nucléiques vers les protéines est à sens unique. Par ailleurs, il est un des premiers auteurs à proposer en 1968 que le matériel génétique des premiers organismes vivants ait été de l'ARN. Enfin, en 1980, il contribue à l'élaboration de la notion d'ADN égoïste.


Références
Watson, J.D. & Crick, F.H.C. (1953) A structure for desoxyribose nucleic acid. Nature 171, 737-738. 
Watson, J.D. & Crick, F.H.C. (1953) Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature 171, 964-967. 
Crick, F.H.C. (1968) The origin of the genetic code. J. Mol. Biol. 38, 367-379. 
Crick, F.H.C. (1970) Central dogma of molecular biology. Nature 227, 561-563 
Orgel, L.E. & Crick, F.H.C. (1980) The selfish DNA : the ultimate parasite. Nature 284, 604-607.


Née en 1920, Franklin suit ses études à l'université de Cambridge. En 1947, elle travaille dans un laboratoire parisien, jusqu'en 1951, où elle rejoint le King's College, pour travailler sur la structure de l'ADN. Ses rapports avec ses collègues sont médiocres, et Watson en a brossé un portrait caricatural dans La double hélice. C'est toutefois à elle que l'on doit tous les clichés de diffraction aux rayons X de l'ADN, qui permettent à Watson et Crick de proposer leur modèle en 1953. Elle reconnaît d'autre part deux formes distinctes pour les cristaux d'ADN, qu'elle nomme forme A (forme compactée) et forme B (forme hydratée). Ces travaux sont publiés dans le même numéro de Nature que celui décrivant le modèle de Watson et Crick.
En mars 1953, Franklin quitte le King's College pour le Birbeck College. Elle se consacrera désormais à l'étude du virus de la mosaïque du tabac, dans le laboratoire du professeur Bernal. Une leucémie l'emportera à l'âge de 38 ans.

Références
Franklin, R.E. & Gosling R.G. (1953) Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature 171, 742.


Franklin, R.E. & Gosling R.G. (1953) Evidence for 2-chain helix in crystalline structure of sodium 
desoxyribonucleate. Nature 172 156. 
Klug,A. (1968) Rosalind Franklin and the discovery of the structure of DNA. Nature 219, 808-844.
http://www.nobel.se


Linus Pauling (1901 - 1994) fut sans doute le plus grand chimiste de ce siècle, qui aborda avec succès des domaines variés tels que la physique quantique, la structure des cristaux, ou la biologie moléculaire. Ses premières contributions essentielles concernent la liaison chimique, et il est en particulier le premier à reconnaître l'importance des liaisons faibles. En 1940, avec Delbrück, il développe l'idée que la 
complémentarité stéréospécifique est à la base des interactions moléculaires en biologie. Il publie deux livres qui ont révolutionné la chimie : La nature de la liaison chimique (1939), et Chimie générale (1947). Plus que tout autre, il contribue à faire de la structure des molécules le thème essentiel de la biochimie. Il élucide la structure de plusieurs centaines de substances minérales, et il est le découvreur de certaines structures protéiques, telles que l'hélice alpha et le feuillet beta;. Il aussi le premier à apporter une explication moléculaire à une maladie génétique : l'anémie falciforme, pour laquelle il propose comme origine une altération de l'hémoglobine.
L'ensemble de ces travaux lui vaut un premier prix Nobel en 1954. Un prix Nobel de la paix lui est aussi attribué en 1962, en raison de ses engagements pacifistes en faveur du désarmement (seuls trois autres chercheurs ont reçu deux prix Nobel : Marie Curie, Antoine-Henri Becquerel, et Frederick Sanger). Là encore, il fait figure de pionnier, puisqu'il est le premier à avancer que les radiations puissent être dangereuses pour le patrimoine génétique.
Pauling est aussi à l'origine de l'utilisation des séquences de protéines pour la reconstruction d'arbres 
phylogéniques, et il propose avec Emile Zuckerkandl, en 1965, le concept d'horloge moléculaire. Il travaille aussi sur la structure de l'ADN, et a été à ce titre le concurrent le plus sérieux de Watson et Crick . En 1953, il publie ce qu'il pense en être la structure : trois chaînes de riboses phosphates s'enroulant étroitement l'une autour de l'autre, et les bases azotées pointant radialement vers l'extérieur de ce faisceau. Cette idée totalement erronée s'explique en partie par le fait que Pauling n'avait pas accès aux résultats récents de Rosalind Franklin .
A partir des années 70, il s'intéresse aux antioxydants, en particulier la vitamine E et la vitamine C. Il accorde à ces molécules d'importantes vertus anti-cancérigènes et anti-vieillissantes. Ceci le conduit vers un singulier engouement pour la vitamine C, dont il prône la consommation sans modération...


Références
Pauling, L. (1948) Nature of forces between molecules of biological interest. Nature 161, 707-709. 


Pauling, L. & Delbrück, M. (1940) The nature of the intermolecular forces operative in biological processes. Science 92, 77-79. 


Pauling, L., Itano, H.A. & Singer, S.J. (1949) Sickle cell anemia, a molecular disease. Science 110, 64-66.


Pauling, L., Corey, R.B. & Branson, H.R. (1951) The structure of proteins : two hydrogen-bonded helical 
configurations of the polypeptide chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 37, 205-211. 


Pauling, L. & Corey, R.B. (1953) A proposed structure for the nucleic acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39, 84-97.


Zuckerkandl, E. & Pauling, L. (1965) Molecules as documents of evolutionary history. J. Theoret. Biol. 8, 
357-366.