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Emergence de la paléogénétique

Texte de Eva-Maria Geigl<br/> UFR des Sciences de la vie<br/> Université Pierre et Marie Curie Paris 6<br/>

geigl@ijm.jussieu.fr


 Introduction
Qu'a-t-on analysé avec l'ADN récupéré à partir d'échantillons anciens ou fossilisés?
 Dans quel état se trouvait l'ADN fossile?
 Pourquoi l'ADN était-il préservé dans ces échantillons?
 Difficultés méthodologiques
 Analyse de restes de repas d'Homo erectus ayant vécu en Bretagne il y a 450 000 ans
 Exemple d'études paléogénétiques publiées jusqu'à ce jour
          * Génétique des populations
          * Identification d'un individu
          * Relations de parenté (cimetières et sépultures)
          * Détermination du sexe
          * Migrations et démographie
          * Paléopathologie
          * Domestication des animaux
          * Agriculture
          * Reconstruction phylogénétique
          * Etude de la diversité intraspécifique

Références bibliographiques

 

   1. Introduction


L'évolution moléculaire est un processus historique au cours duquel l'ADN accumule des changements (mutations) générés par des événements aléatoires entraînant des modifications de propriétés de l'organisme qui, si elles sont favorables, seront fixés par des processus sélectifs. Jusqu'à très récemment, les chercheurs s'intéressant à l'évolution moléculaire ne pouvaient reconstruire ce processus qu'à partir de la connaissance de la structure actuelle de l'ADN dans les espèces vivantes. Par contre, les paléontologues peuvent reconstruire l'évolution en utilisant les témoins des événements passés: les fossiles. Toutefois, ils effectuent cette reconstitution en se basant uniquement sur des critères morphologiques ce qui peut être assez trompeur, des espèces très proches, voir des individus d'une même espèce, pouvant avoir des différences morphologiques très importantes. A l'inverse, des espèces éloignées peuvent se ressembler du fait de l'évolution convergente, si elles sont soumises à des conditions de sélection similaires. Les données issues des approches de génétique moléculaire et de paléontologie se heurtent donc parfois. Les différences culturelles des paléontologues et des généticiens moléculaires sont telles qu'il arrive assez fréquemment que chacun campe sur ses positions, et ces querelles entre "anciens et modernes" ne se résolvent pas de manière consensuelle laissant ceux qui ne sont pas indissolublement liés à l'une de ces 2 écoles de pensée sans certitude quant aux hypothèses les plus vraisemblables. Un pont pourrait être jeté entre ces deux approches si l'on était en mesure d'analyser le matériel génétique ancestral persistant dans les fossiles. De telles informations enrichiraient aussi bien l'approche paléontologique que celle de la génétique moléculaire de l'évolution.
La paléogénétique, science qui étudie le matériel génétique fossile, est donc théoriquement capable de conforter des données issues de la paléontologie en empruntant l'approche directe de l'analyse de l'évolution moléculaire: elle permet de mesurer directement les mutations et les changements de fréquences alléliques au cours du temps ce qui était possible jusqu'à présent uniquement par déduction de la distribution d'allèles dans les populations actuelles.
 
Les données paléogénétiques permettront de tester la validité des arbres phylogénétiques proposés par la génétique de l'évolution confrontés à ceux postulés par la paléontologie vice-versa. Le potentiel de cette approche devient immédiatement évident lors de l'insertion de données moléculaires obtenues à partir des fossiles d'espèces éteintes dans les arbres phylogénétiques issus d'études génétiques des espèces actuelles. Dans ces cas-là, même des exemples rares d'uniques spécimens conservés ont une grande valeur. De plus, les données paléogénétiques sont indépendantes de certains biais paléontologiques dus à son approche morphologique, comme l'âge de l'organisme au moment de sa mort, le dimorphisme sexuel, les variabilités individuelles, les adaptations climatiques, ou encore les ravages du climat ou des prédateurs brisant les os. Pour les archéologues, la détermination du sexe d'un individu à partir d'ossements ainsi que la détermination des relations de parenté entre différentes sépultures est d'un très grand intérêt afin de pouvoir interpréter la structure sociale d'une communauté dont les vestiges sont analysés sur un site archéologique.
 
Il serait aussi très souhaitable pour les généticiens de populations de connaître la structure génétique passée de populations actuelles afin de mieux comprendre l'évolution des populations et le rôle des migrations et des goulots d'étranglement. Souvent les connaissances de relations phylogénétiques et de la biogéographie historique sont confondues à cause de l'information génétique limitée aux parents actuels. L'importance de la quantité de matériel ancien disponible dans les musées devrait permettre de tester les hypothèses phylogénétiques et biogéographiques qui ont été avancées à partir des analyses de populations actuelles lorsque les méthodes d'analyse d'ADN ancien seront suffisamment fiables et standardisées.
 
Finalement, l'analyse directe de l'ADN conservé dans des fossiles pourrait fournir des informations capitales pour l'analyse de l'évolution moléculaire. L'étude des processus génétiques moléculaires rapides (événements de recombinaison entre les séquences minisatellites, évolution moléculaire des virus et évolution des séquences impliquées dans le processus de la domestication) est le seul moyen de déterminer l'existence et la vitesse de l'horloge moléculaire pour une séquence donnée.

Qu'a-t-on analysé avec l'ADN récupéré à partir d'échantillons anciens ou fossilisés?


Cinq de ces analyses, décrites dans le paragraphe suivant, montrent l'apport de la paléogénétique à l'interprétation des données archéologiques.


1. La comparaison des séquences de la région non-codante majeure dans l'ADN mitochondrial d'un grand nombre d'individus humains contemporains d'Afrique, d'Europe, du Japon, d'Asie et d'Amérique (population indigène) avec les séquences de la même région mitochondriale extraite à partir de momies d'Américains indigènes ainsi qu'à partir d'os de Japonais de la période des Jomons (vieux de 6000-3000 années) et des Ainus modernes (vieux de 300-200 années) a montré que les Japonais peuvent être classés en deux groupes distincts (Horai et al., 1991). De plus, les données sont en faveur de la théorie du peuplement du Japon par immigration qui suppose qu'un nombre considérable d'immigrants de l'Asie continentale a contribué à la formation du peuple japonais moderne. Elles affaiblissent, par contre, la théorie de transformation postulant l'évolution directe du peuple néolithique de Jomon pour donner celui du Japon moderne sans addition et mélange de l'extérieur.
 

2. La domestication des espèces animales et végétales peut être étudiée au niveau de gènes nucléaires. Une analyse du gène Adh2 , codant pour l'alcool déhydrogénase, extrait à partir de plusieurs spécimens archéologiques de maïs vieux entre de 440-4700 années, a montré que la diversité génétique du maïs ancien ressemble celle du maïs moderne. Les vestiges archéologiques fossiles indiquent une apparition soudaine du maïs domestiqué il y a 7000 ans en Amérique Centrale. Le maïs est caractérisé par une variabilité morphologique et génétique entre les races différentes. La variabilité entre les allèles anciens est plus grande que celle entre les allèles anciens et les allèles modernes. Ce résultat (Goloubinoff et al., 1993) permet la conclusion que le "pool" génétique doit avoir plusieurs millions d'années et précède alors la période de la domestication. Plusieurs possibilités pour la domestication du maïs en Amérique Centrale peuvent, par conséquent, être envisagées qui ne s'excluent pas forcément, l'une l'autre l'une l'autre:

1)Le maïs a été domestiqué à partir d'un seul ancêtre sauvage étant croisé avec le téosinte par la suite, avant d'être exporté en Amérique du Sud.

2) Le maïs a été domestiqué à partir d'une population d'ancêtres sauvages contenant un grand nombre de sites variables dans le gène, le polymorphisme allélique, donc caractérisé par un polymorphisme allélique important qui a été perpétué à la suite.

3) Le maïs a été domestiqué indépendamment à partir de plusieurs ancêtres sauvages croisés par la suite entre eux et avec le téosinte sauvage.

Des données récentes montrent deux expansions génétiquement distinctes en Amérique du Sud. La deuxième expansion semble représenter une introgression du "pool" génétique du téosinte dans celui du maïs. Cette étude a montré une accélération du taux de l'évolution de la séquence Adh2 (Allaby et al., 2000).
 

3. Un autre exemple de l'utilité de l'analyse paléogénétique de restes biologiques de sites archéologiques est l'étude de graines de blé et d'autres plantes agricultures, comme le radis (Brown et al., 1994; O'Donoghue et al., 1996). Ces études analysent les variétés de blé, par exemple, à partir de grains carbonisés trouvés dans les sites archéologiques du "Croissant Fertile" au Moyen-Orient et en Europe afin de retracer les interactions des populations préhistoriques et le progrès de l'agriculture. L'existence de graines du même type sur deux sites est une indication d'un contact entre les deux populations. Le plus souvent, l'approche paléobotanique ne permet pas de répondre à cette question du fait de l'absence de différences morphologiques entre les graines, surtout pour les variétés du blé nu pour lesquelles la distinction est normalement impossible. Par contre, l'étude des polymorphismes des gènes tels que ceux codant pour les gluténines, ainsi que la détermination du degré de ploïdie entre espèces tétra- et hexaploïdes à partir des ARN ribosomiques peuvent résoudre ce problème (Brown et al., 1994).

 

4. La paléogénétique peut jouer un rôle important dans la reconnaissance et la conservation d'espèces en danger. Le couple paléontologie-paléogénétique peut ainsi intervenir dans la protection de l'environnement. Une étude du matériel génétique de canards sur les îles de Hawaii (Cooper et al., 1996) a démontré qu'ils étaient largement répartis sur une grande partie des îles au cours du Pléistocène. Sa disparition est probablement le résultat des mêmes facteurs, introduits par l'homme préhistorique, responsables de l'extinction d'autres taxons natifs aux îles pacifiques, c'est-à-dire la chasse, la destruction de l'habitat, l'introduction de prédateurs et de pathogènes. Ce résultat, qui n'a pas pu être obtenu que par une analyse paléontologique (car la morphologie de ces squelettes n'est pas assez caractéristique), justifie la réintroduction de ces canards sur plusieurs îles de la région afin de sauvegarder cette espèce.

 

5. Les hommes de Néanderthal auraient habité l'Europe et l'Asie de -300.000 à -30.000 ans. Les paléoanthropologues discutent beaucoup de la relation entre homme de Néanderthal et homme actuel: le néanderthalien est-il un de nos ancêtres directes ou représente-t-il une espèce distincte et éteinte? Pour trancher la question, une approche génétique a été utilisée reposant sur l'amplification par PCR de petits fragments chevauchant d'ADN mitochondrial provenant de deux individus néanderthalien d'origine différente. L'analyse a porté sur la région contrôle de l'ADN mitochondrial qui est hypervariable et donc susceptible de révéler les différences entre espèces très proches voir entre sous-espèces (Krings et al., 1997; Ovchinnikov et al., 2000). Cette étude a montré que la séquence du néanderthalien était assez éloignée des séquences humaines actuelles et suggère que la lignée néanderthal se serait séparée de la lignée humaine il y a 5 ou 600.000 ans alors qu'on fait reporter l'ancêtre commun à tous les hommes actuels à environ 170.000 ans. Les auteurs en concluent ainsi que les populations de néanderthaliens en Europe ne se sont pas mélangées avec les populations d'hommes modernes avec qui ils cohabitaient. Il faut toutefois noter que l'ADN mitochondrial est transmis à travers les générations par les femelles et donc l'étude permet seulement de conclure que nous n'avons pas eu une arrière grand-mère néanderthalienne.

Dans quel état se trouvait l'ADN fossile?


L'analyse paléogénétique bien que très utile est loin d'être triviale car ADN fossile récupéré a été fortement fragmenté et altéré. La putréfaction, donc la dégradation du matériel organique due à l'action d'enzymes de micro-organismes et à l'autolyse par les enzymes dégradatrices de l'organisme qui vient de mourir conduisent à une fragmentation des molécules longues d'ADN.
Plusieurs sites de la molécule d'ADN sont susceptibles de subir une attaque hydrolytique, en particulier, la liaison entre la désoxyribose et les bases (Lindahl et Nyberg, 1972).

La forme majeure de modification post-mortem de l'ADN est l'oxydation endommageant à la fois les bases (d'où les mutations lors de la réplication) et les désoxyriboses (coupures des brins) (Pääbo, 1989). Les bases pyrimidiques (Thymine et Cytosine) sont encore plus sensibles à l'oxydation que les bases puriques. Les bases cytosine et thymine sont sous-représentées dans les extraits d'ADN purifiés à partir des fossiles des dérivés de pyrimidines ont été trouvés en grande quantité dans ces extraits (Pääbo, 1989) La rupture de la liaison entre les bases et les désoxyriboses fragilise le brin d'ADN et entraînent sa cassure.

De plus, des pontages entre des molécules ADN-ADN sont très fréquents, ainsi que des structures complexes de molécules d'ADN pontées et condensées (Pääbo, 1989).

Le groupe de S. Pääbo a proposé (Poinar et al., 1996) que la préservation de l'ADN dépend des mêmes conditions que la transformation des L-énantiomères en D-énantiomères, les deux formes d'isomères optiques des acides aminées, la forme L des acides aminés étant la seule présente dans des cellules vivantes. Après la mort de la cellule, l'acide aminée L subit la racémisation en produisant la forme D. Puisque le taux de racémisation, surtout de l'acide aspartique, dépend des mêmes paramètres que celui de la dépurination de l'ADN (présence de l'eau, température, ions métalliques), la détermination du taux de la racémisation pourrait indiquer l'état de préservation de l'ADN. En effet, uniquement des échantillons avec un taux D/L de racémisation de l'acide aspartique bas (inférieur à 0.08) ont fourni des produits PCR dans cette étude en utilisant des techniques d'extraction d'ADN développés sur les tissus modernes. Ce résultat limiterait la durée de la "survie" de l'ADN à 100 000 ans dans des régions froides et diminuerait l'espoir de pouvoir récupérer de véritable ADN de dinosaures. Il reste cependant à remarquer qu'il était impossible d'établir une corrélation générale entre l'âge d'un échantillon, le rendement d'extraction d'ADN et le degré de racémisation. En effet, des travaux récents ont mis en question l'utilité de la racémisation pour la détermination de la conservation de l'ADN à cause de la différence fondamentale entre les processus de dépurination et de racémisation (Collins et al., 1999).

Pourquoi l'ADN était-il préservé dans ces échantillons?


Les principaux facteurs influençant la conservation de l'ADN sont le pH, la température, l'humidité et la pression.

 Les déserts chauds, basiques et secs sont des lieux où les phénomènes d'hydrolyse sont ralentis. De plus, la dessiccation des restes se produit très rapidement après la mort, ce qui minimise l'action des bactéries et des enzymes autolytiques. Ainsi les graines trouvées avec les momies égyptiennes ont fourni des séquences d'acides nucléiques (Rollo et al., 1991). Ceci semble vrai aussi pour quelques momies elles-mêmes, bien que le taux de réussite soit extrêmement faible car seulement quelques échantillons parmi des centaines ont fourni des produits de PCR (Pääbo, 2000).

Les grottes où les fluctuations climatiques sont très réduites se sont relevées comme source potentielle de données paléogénétiques car endroits priviligiés de conservation. On est parvenu, à partir des os trouvés dans des grottes européennes, de reconstituer la phylogénie de l'ours de cavernes en Europe (Hänni et al., 1994). De manière générale, une étude récente montre qu'en fait, ce n'est pas l'âge du spécimen fossile qui est en corrélation étroite avec la survie de l'ADN mais son "âge thermique": seulement la température basse permet la conservation de l'ADN (Smith et al., sous presse).

Dans le permafrost et les glaciers, la décomposition est ralentie, voir franchement arrêtée. L'ensemble des processus d'autolyse et de dégradation microbienne sont probablement inhibé au moment de la mort. C'est dans ce type d'environnement que l'on a retrouvé les spécimens sans doute les mieux préservés, par exemples les mammouths congelés de Sibérie (Johnson et al., 1985) à partir desquels on a même pu amplifier des séquences nucléaires (Greenwood et al., 1999), ou encore, de nombreuses momies humaines (Nielsen et al., 1994; Hänni et al., 1994), dont l'exemple le plus célèbre est "l'homme des glaces" (Seidler et al., 1992). Une étude récente a décrit l'analyse de sept fossiles d'ours brun conservés dans le permafrost vieux de 14 à 42.000 ans (Leonard et al., 2000). La conclusion de cette étude phylogéographique est que les populations d'ours actuelles, séparées géographiquement, sont probablement issues d'une seule population. Cette étude illustre bien, malgré le nombre très limité d'échantillons analysés, l'utilité de remonter dans le temps afin d'examiner la base de la distribution phylogéographique actuelle (Pääbo, 2000).

L'enlisement d'animaux dans des fosses d'asphalte (comme Rancho La Brea à Los Angeles qui renferme environ deux millions d'animaux) entraîne la dégradation de leurs tissus mous, mais les parties osseuses, infiltrées par le pétrole naturel, semblent favoriser la préservation de l'ADN, probablement adsorbé dans la matrice osseuse. La conservation est excellente parce qu'il s'agit d'un milieu très faible en oxygène ne permettant qu'une faible croissance des bactéries de décomposition. Ainsi, outre leur densité importante en restes, ces fosses à goudron permettent une bonne conservation de l'ADN: on a ainsi pu analyser l'ADN du tigre à dents de sabre, Smilodon fatalis, vieux de 14.000 ans (Janczewski et al., 1992).

Les tourbières de Windover, en Floride, milieux pauvres en oxygène et en pH neutre, n'ont pas seulement préservé la morphologie d'environ 180 squelettes humaines mais aussi permis d'analyser l'ADN extrait à partir des os et cerveaux de ces individus vieux de 7000 ans (Hauswirth et al., 1994; Lawlor et al., 1994; Doran et al., 1986).

Les musées qui contiennent des animaux taxidermisés deviennent de plus en plus une source importante d'ADN (Roy et al., 1994a). Cependant, la plupart des restes ont été traités par l'homme avec des produits chimiques et certains de ces traitements peuvent entraîner une dégradation de l'ADN. Un autre type d'inconvénient de ces restes réside dans leur haut degré de contamination par de l'ADN humain car ils ont été souvent manipulés sans précaution.

Les musées contiennent aussi des herbiers, autre source appréciable d'ADN et des spécimens conservés dans l'éthanol dont on peut extraire de l'ADN. Par contre les échantillons conservés dans le formol constituent également une très mauvaise source d'ADN ancien car le formol entraîne une fixation des tissus (couplage ADN/autres composants) et l'ADN devient très difficile à extraire.

On doit également citer les archives médicales, banques de sang congelé, frottis congelés, lames fixées etc. qui ont permis de retracer l'histoire de certaines maladies.

Les données les plus fortement contestées, et pour lesquelles on ne sait pas encore si elles sont la conséquence d'artéfacts de contamination ou si elles sont authentiques, concernent les séquences d'ADN obtenues à partir de fossiles vieux de plusieurs dizaines, voir centaines de milliers d'années.

Un résultat paléogénétique spectaculaire, obtenu il y a presque dix ans mais qui n'a pas été reproduit depuis, est l'obtention d'ADN à partir de feuilles de magnolia vieilles d'environ 17 millions d'années. Ces feuilles proviennent d'un site de compression, le gisement de Clarkia en Idaho, qui ont été enfouies rapidement sous des conditions d'anaérobiose et de haute pression chassant l'eau de cellules, ce qui aurait permis cette exceptionnelle longévité (Golenberg, 1991; Sidow et al., 1991; Logan et al., 1993).

L'autre milieu particulier qui pourrait permettre la conservation de l'ADN à très long terme est l'ambre. Cette résine végétale constitue un véritable coffre fort pour la préservation squelettaire ou morphologique de petits animaux et de végétaux, puisque l'animal ou le végétal est englué dans une gangue le protégeant de l'humidité. L'ambre est à ce jour le matériau qui aurait fourni les plus anciennes traces d'ADN fossile: d'une abeille vieille d'environ 35 millions d'années (Cano et al., 1992a et b) et d'un charançon vieux d'environ 135 millions d'années (Cano et al., 1993). Par contre, ces résultats n'ont pas pu être répétés et leur validité reste donc en suspens (Austin et al., 1997) bien que quelques auteurs continuent à affirmer qu'ils peuvent isoler de l'ADN de tels spécimens. Même l'ADN d'une espèce de bactéries (Bacillus sphaericus, une espèces vivant en symbiose avec les abeilles), isolée à partir de l'abdomen de cette abeille conservée dans l'ambre depuis environ 35 millions d'années, a été analysé grâce à sa réanimation (Cano et Borucki, 1995), résultat discuté vivement par la communauté scientifique.

Une analyse d'un moucheron conservé dans l'ambre a suggéré que deux facteurs essentiels étaient responsables du haut degré de préservation morphologique et moléculaire. Il s'agit d'une part d'un phénomène physique connu sous le nom de "déshydratation inerte": les composés de la résine provoquent la rétraction du tissu et il en résulte une momification extrême, véritable embaumement naturel (entrée de sève dans la cavité corporelle). Le second facteur est l'action antimicrobienne de la résine (riche en sucres et en terpénoïdes) qui, avec l'absence d'oxygène dont les organismes aérobies ont besoin, protègent les tissus de la dégradation.

Le résultat le plus spectaculaire par rapport à l'ancienneté du matériel conservé a été fourni par une étude récente montrant la ranimation d'une bactérie halotolérante de 250 millions d'années à partir d'un cristal de sel (Vreeland et al., 2000). Cette découverte spectaculaire est soutenue par des données physico-chimiques qui montrent la conservation exceptionnelle d'enzymes dans des environnements saturés en sel (Madern et al., 2000).

Difficultés méthodologiques


Cependant, la nouvelle discipline a encore fourni peu de contribution à l'étude de l'évolution, principalement à cause des graves problèmes techniques rencontrés. Au problème de la dégradation et de l'altération de l'ADN, entraînant une grande perte d'information, s'ajoute un problème majeur : la contamination par de l'ADN moderne rendant ces analyses extrêmement difficiles. En effet, la moindre contamination des spécimens anciens et fossiles par de l'ADN moderne aboutit à des données fausses qui proviennent de cet ADN moderne (voir plus loin). Le plus souvent cet ADN contaminant est de surtout d'origine humaine provenant des archéologues, paléontologues, généticiens, bref, toute personne manipulant les spécimens sans précautions particulières, C'est pour cette raison que ce type d'analyse s'effectue aujourd'hui dans des laboratoires installés spécialement pour cette fin dans lesquels on travaille comme dans les laboratoires de diagnostique PCR.
L'extraction de l'ADN à partir de fossiles nécessite la modification des procédures utilisées pour isoler l'ADN des échantillons modernes. D'autant plus que l'adsorption sur une matrice minérale semble favoriser la préservation et que le pontage avec d'autres molécules est un phénomène probable avec les échantillons anciens. Il faut donc pouvoir dissocier l'ADN de ces autres composants qui lui sont intimement associés. Actuellement, on ne connaît pas suffisamment bien la nature de ces associations pour pouvoir prédire les conditions expérimentales optimales et la démarche expérimentale empirique restera déterminante pendant encore quelques années.

Une fois l'ADN isolé, il pourra être analysé. Actuellement, deux approches principales peuvent être considérées: 1) l'analyse directe de l'ADN par hybridation moléculaire (Southern, 1975), 2) l'analyse après amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). La première approche permettra d'obtenir des informations globales sur l'ADN, par exemple, identifier le taxon d'origine de l'organisme dont il provient (Geigl, 1997a). La deuxième approche permettra d'obtenir des informations beaucoup plus précises (séquences nucléotidiques) sur différents fragments du génome fossile. Grâce à l'amplification, cette deuxième approche permet de travailler avec une quantité de matériel beaucoup plus faible, par contre elle est assez sensible à la présence de contaminants et d'inhibiteurs: La technique de la PCR est extrêmement sensible et peut amplifier un très petit nombre de molécules, dont des molécules contaminatrices. De plus, la polymérase préfère largement l'ADN intact et donc moderne. Par conséquent, ce n'est pas l'ADN du fossile qui sera amplifié le plus souvent mais celui du manipulateur, de l'archéologue, du conservateur, etc.... Cela peut fausser les résultats. Les échantillons fossiles contiennent de nombreuses molécules inhibitrices de la PCR empêchant l'action de la polymérase et dont la nature est actuellement inconnue. Ces molécules semblent être produites souvent produites au cours du vieillissement des échantillons biologiques. On soupçonne qu'une source majeure d'inhibiteurs sont les sucres réducteurs conduisant à la formation d'acides humiques et donnant une couleur brune-jaune caractéristique aux extraits.

A partir de la plupart des extraits d'ADN fossile, il n'est possible d'amplifier par PCR que de petits fragments qui ne dépassent généralement pas 500 paires de nucléotides parce que l'ADN fossile est fortement fragmenté (Pääbo et al. , 1989). Ceci pose un problème lors de la reconstruction des arbres phylogéniques. En effet, plus les écarts des valeurs conduisant à ces arbres sont importants plus la séquence analysée est courte ce qui diminue la fiabilité d'arbres phylogéniques.

La PCR peut fournir des séquences anciennes correctes lorsque l'amplification s'effectue sur quelques dizaines, voire quelques centaines de fragments d'ADN ancien. En effet, lors de l'analyse du produit final d'une réaction d'amplification, toute erreur sur une position donnée dans la séquence analysée, peut être compensé par l'amplification des autres molécules qui ne portent pas d'erreur à cet endroit (Rollo et al., 1988; Rogan & Salvo, 1990). Ceci est vrai si l'ADN amplifié est analysé globalement sans passer par une étape de clonage bactérien. Dans le cas du clonage bactérien, une seule molécule est amplifiée in vivo (dans la bactérie), ce qui peut conduire à des erreurs notables que l'on peut minimiser en analysant un nombre important de clones différents. D'autre part, la PCR peut reconstituer des molécules d'ADN de taille entre les deux amorces complète à partir de plusieurs molécules anciennes partiellement dégradées (Pääbo et al., 1990). Au cours du premier cycle, les amorces s'accrochent à des molécules incomplètes et la synthèse de la copie s'arrête au site endommagé. Au cycle suivant, les nouvelles molécules d'ADN partielles se séparent en deux brins et servent d'amorces, plus longues que les oligonucléotides initiaux qui vont permettre de compléter la synthèse à partir d'autres copies de la séquence d'ADN que l'on cherche à amplifier. Ces sauts de molécule à molécule permettent de rassembler des informations provenant de plusieurs molécules partiellement dégradées. Lorsque les conditions sont favorables, la PCR amplifie ainsi des séquences plus longues que les fragments de l'échantillon original (Pääbo et al., 1990). Par contre, si la population de molécules initiales est hétérogène, on peut reconstituer un fragment d'ADN nouveau: chimère entre les différentes molécules initiales. Ceci ne pose pas problèmes dans le cas des séquences mitochondriales des mammifères pour lesquelles l'homoplasie est la règle. Par contre, la "PCR sautante" (saltatoire?) peut générer, par recombinaison durant l'amplification, des séquences erronées de séquences chromosomiques à partir d'individus anciens hétérozygotes. La PCR permet donc d'amplifier des molécules très endommagées bien que les dommages présents dans l'ADN ancien engendrent une corrélation fortement inverse entre efficacité d'amplification et taille des produits d'amplification. Ceci met des limites à la longueur des amplicons qu'on peut obtenir. Par contre, on peut espérer améliorer encore l'efficacité de la PCR, en réparant avant l'amplification, les dommages subis par l'ADN ancien grâce à d'autres moyens enzymatiques (Rollo et al., 1988; Rogan & Salvo, 1990).

Analyse de restes de repas d'Homo erectus ayant vécu en Bretagne il y a 450 000 ans

 

Je me suis intéressé à la conservation de l'ADN dans les ossements du gisement Paléolithique inférieur de Menez-Dregan I (Finistère).

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Le site dont la coupe stratigraphique est montrée dans la figure associée est caractérisé par 3 couches anthropiques (en rouge sur le schéma) ayant fourni toutes des foyers qui comptent parmi les plus anciens connus (Monnier et al., 1994). Les fossiles ont été trouvés dans la couche 9 datée d'environ 465 000 ans.

osmenezbregan

 Ils sont conservés dans ou autour de foyers et présentent donc les restes des repas d'H. erectus: selon toute probabilité ils ont été chauffés dans le feu lors du "barbecue" de l'homme de Menez-Dregan. Ces ossements ne sont pas déterminables par une approche paléontologique due à leur taphonomie particulière. En effet, ils ont subi une forte compaction ce qui se montre aussi bien au niveau morphologique que microscopique: L'image de la microscopie électronique à balayage montre une histologie fortement compactée . Ils ont alors été soumis à une étude moléculaire dans l'espoir de pouvoir déterminer leur origine zoologique, information importante pour l'interprétation du site archéologique.
Cet espoir était faible car jusqu'à ce jour, les fossiles d'un âge aussi important n'ont pas fourni des résultats paléogénétiques et effectivement ces échantillons ne permettent pas d'obtenir des produits de PCR dans des conditions fiables. Cet échec a été expliqué avec les résultats d'une extrapolation du taux de la dépurination de l'ADN en solution: on peut calculer qu'un fragment d'ADN de 800 pb doit être dégradé au bout de 5000 ans (Lindahl & Nyberg, 1972). Cependant, ce calcul part de l'hypothèse que la chimie dans un fossile est identique à celle du système physiologique, c'est-à-dire, la chimie des systèmes aqueux. Si cela est le cas, aucune trace d'ADN ne devrait être conservée dans des fossiles du Pléistocène et l'analyse ciblée resterait infructueuse. Par contre, les chercheurs admettent dans leur ensemble l'authenticité de données d'amplification par PCR à partir de fossiles plus anciens ayant jusqu'à 40.000 ans d'âge (Leonard et al., 2000; Krings et al., 1997; Ovchinnikov et al., 2000). Ceci indique que dans certains cas rares les conditions taphonomiques sont telles que les lois de la chimie des systèmes aqueux ne sont plus valables et que l'ADN peut être conservé beaucoup plus longtemps.


Le problème logique que posent les démarches expérimentales actuelles est que les méthodes de purification et d'analyse de l'ADN dans les fossiles dérivent directement de celles conçues pour les systèmes biologiques vivants et donc assument que l'ADN fossile a les mêmes propriétés physico-chimiques que l'ADN moderne. Or, si c'était le cas, il ne devrait pas résister plus de 5000 ans. Pour que l'ADN résiste plus longtemps, il faut qu'il y ait eu une modification de ses propriétés physico-chimiques et il y a donc de fortes chances qu'il ne va plus continuer à se comporter comme de l'ADN moderne au cours de la purification. En effet, un fossile n'est plus un système biologique mais un système géologique pour lequel les lois physiologiques ne s'appliquent plus.

Contrairement à la méthode de la PCR, l'hybridation moléculaire ADN-ADN ne demande pas que les propriétés physiques et chimiques de l'ADN fossile ressemblent strictement à celles de l'ADN moderne. En effet, l'hybridation est beaucoup moins sensible aux contaminations par d'autres molécules et aux inhibiteurs d'enzymes. La méthode peut donc être utilisée sur des extraits fossiles bruts ainsi que pour le développement de procédures de purification nouvelles. De plus, l'hybridation peut tolérer 20-40% de mésappariments (en fonction des conditions expérimentales) et peut donc accomoder un pourcentage plus important de bases transformées que la PCR. Finalement, l'hybridation moléculaire permet d'analyser les molécules d'ADN originelles directement sans les modifier, contrairement à la PCR.

Ma démarche tenait compte du danger de la contamination tout au long du traitement du fossile dès son prélèvement. Par conséquent, j'ai développé des méthodes de prélèvement en collaboration étroite avec les archéologues (équipe de J.-L. Monnier, Laboratoire d'Anthropologie de l'Université Rennes I, CNRS UMR 153) sur un site du paléolithique inférieur (Hallégouët et al., 1992).

contamination



J'ai donc analysé par hybridation Southern (Southern, 1975) des extraits bruts des fossiles vieux d'demi-million d'années provenant du site de Menez Dregan .Comme sondes, j'ai utilisé de l'ADN génomique moderne provenant de la vache et du cheval choisis comme représentants de deux ordres zoologiques abondants au Pléistocène, les Périssodactyles et les Artiodactyles. Il est fort probable que ces taxons ont composé l'essentiel de l'apport carné des repas de l'H. erectus. Pour tester des éventuelles sources d'ADN moderne contaminant, j'ai utilisé comme sondes l'ADN de l'homme et du sol du même site. Des expériences contrôle avec des espèces modernes ont montré la stringence des conditions utilisées.

J'ai ainsi pu mettre en évidence la persistance d'ADN, en quantité et en qualité suffisantes pour déterminer par l'hybridation moléculaire les taxons de quelques ossements (Artiodactyla et Perissodactyla; Geigl, 1997). Ceci représente les traces d'ADN les plus anciennes actuellement caractérisées.

Surtout, cette étude a prouvé, en vérifiant, d'une façon systématique, le sort de l'ADN dans les différentes étapes de purification, que les méthodes d'extraction d'ADN à partir de fossiles qui sont actuellement utilisées dans ce domaine, ne sont pas adaptées aux vieux fossiles. L'hybridation des différentes étapes d'une procédure d'extraction standard d'un os de vache moderne a montré que l'ADN est solubilisé dès la première étape et peut donc être purifié. Par contre, la même procédure ne permet pas de solubiliser (et donc de purifier) l'ADN dans l'extrait fossile. Celui-ci reste associé à la phase minérale, le culot, qui est généralement jeté au cours de la procédure habituelle.

En conclusion, l'hybridation moléculaire a permis de mettre en évidence la présence de matériel génétique dans ces fossiles qui échappe à l'analyse via l'amplification enzymatique (PCR), car il est perdu au cours des étapes de purification nécessaires pour la PCR.

Il semble donc que l'ADN dans ces vieux fossiles est conservé grâce à l'adsorption à la phase minérale. Par conséquent, il n'est pas soumis à la chimie aqueuse. Cela peut expliquer sa conservation qui serait due à une déviation des conditions taphonomiques qui, comme indiqué précédemment, aboutissent normalement à la dégradation totale de l'ADN au bout de 5000 ans.

Cette conservation est-elle un événement particulier ou peut-elle être généralisée à d'autres fossiles?

Les fossiles ont expérimenté une histoire taphonomique très particulière: ils sont issus de parties d'animaux qui vraisemblablement ont été chauffées dans le feu. Ce traitement, résultant en une déshydratation rapide, peut avoir empêché une attaque microbienne de l'ADN qui semble être le facteur majeur pour la dégradation de l'ADN lors de la phase initiale post mortem. Ceci a par la suite pu permettre une adsorption de l'ADN à l'hydroxyapatite, une situation qui ralentit la dépurination et favorise la conservation. Puis, les fossiles ont été enfouis dans un sédiment riche en lipides et pauvre en oxygène et étaient fortement compactés. Ceci aurait pu protéger l'ADN, dans certaines parties de l'os, des réactions avec l'eau, probablement par une diminution des réactions radicales et par une inhibition stérique. Cet état "d'hibernation" peut avoir favorisé la conservation de l'ADN. Mon modèle d'hibernation de l'ADN dans les fossiles (Geigl, sous presse) est encore purement spéculatif et demande une vérification expérimentale rigoureuse aussi bien par des méthodes physico-chimiques que biochimiques.

L'approche de l'analyse par hybridation moléculaire a été testée pendant ces dernières années sur un grand nombre de fossiles d'âge et de provenance différents. Elle a montré la présence de deux populations de molécules d'ADN dans les fossiles: une qu'on peut purifier, une qui reste associée à la phase minérale. La fraction soluble peut servir comme matrice pour l'amplification par PCR. C'est probablement cette fraction-là qui est analysée par les études de l'ADN ancien publiées jusqu'à ce jour. Dans des vieux fossiles par contre, l'hybridation moléculaire a pu montrer l'existence d'une population insoluble de molécules d'ADN associés à la phase minérale. On peut imaginer que les règles de dégradation de ces deux populations de molécules sont très différentes et que la population d'ADN qui est extractible et amplifiable disparaît relativement vite tandis que la population de molécules d'ADN associées au minérale peut être conservée pendant longtemps (Geigl, sous presse). Bien qu'absent ou présent en quantité minime dans l'os moderne, cette fraction insoluble peut être la seule présente dans des vieux fossiles. La détection d'un tel ADN insoluble dans plusieurs fossiles d'histoire taphonomiques différentes suggère que l'on pourra en détecter dans un nombre non négligeable de fossiles anciens à condition que les méthodes d'analyse soient mieux adaptées qu'actuellement aux échantillons géologiques.

L'objectif est maintenant de trouver des nouvelles méthodes d'extraction et d'analyse de cet ADN et de mieux définir les facteurs responsables pour sa conservation dans les fossiles.

Ma découverte montre qu'il devrait être possible à terme de repousser très loin dans le temps les études de données de séquence, et ainsi de compléter fort utilement les arbres phylogénétiques élaborés à partir de séquences actuelles.

Exemples d'études paléogénétiques publiées jusqu'à ce jour:


Génétique des populations

Les études de populations humaines et animales ainsi que de la variabilité génétique, de son évolution spatio-temporelle, et des relations de parenté des populations éteintes sont axées autour de l'analyse des allèles hypervariables des microsatellites (comme les répétitions de dinucléotides CA présents dans ou à proximité de nombreux gènes) qui subissent des mutations avec une fréquence tellement élevée qu'ils sont différents d'un individu à l'autre et permettent alors leur distinction ("genetic fingerprinting"; Jeffreys et al. 1985a et b; Gill et al., 1985; Ginther et al., 1992).
 
Identification d'un individu

 

  • Victimes américaines non identifiées de la guerre du Viêt Nam (Holland et al. 1993) ou de la guerre de Sécession de 1860 (Fisher et al., 1993)
  • Identification des restes de la famille Romanov (Ivanov et al., 1996; Gill et al. 1994; ADNmt et gène d'amélogénine)
  • Identification des restes squelettaires d'une victime d'un meurtre, enterrée depuis 8 ans (Hagelberg et al., 1991; fingerprinting)
  • Identification de restes osseux d'un enfant retrouvé dans le désert américain (Stoneking et al. 1991Restes de Josef Mengele dans un cimetière brésilien (Jeffreys et al., 1992)

 

Relations de parenté (cimetières et sépultures)

 

  • En utilisant 10 loci contentant des microsatellites ainsi que la séquence de la région de contrôle mitochondriale, l'étude paléogénétique de restes squelettaires vieux d'environ 2000 ans a permis d'exclure une relation de parenté directe entre les individus d'un site archéologique japonais (Kurosaki et al., 1993).
  • Restes squelettaires de l'Afrique et du Bassin Méditerranéen vieux de 1200 à 12000 ans (Béraud-Colomb, 1995; gène ß-globine )
  • Population amérindienne pré-Colombienne (Stone & Stoneking, 1991)
  • Populations préhistoriques des îles pacifiques (Hagelberg & Clegg, 1993)

 

  • Momies d'Egypte (Pääbo, 1985; variant mitochondrial dans la région V chez une momie égyptienne de 2000 BP, Hänni et al., 1994); d'Amérique du Sud (Rogan & Salvo, 1994)


Détermination du sexe

 

  • L'existence d'une courte séquence répétée (DYZ1) spécifique du chromosome Y a permis de déterminer le sexe des restes squelettaires d'un site funéraire du 17ème siècle (Hummel & Herrmann, 1991)
  • En profitant d'un polymorphisme de taille entre les allèles du gène amelogenin portés par les chromosomes X et Y (Mannucci et al., 1994; Sullivan et al., 1993) il a été possible d'identifier le sexe des restes de la famille du Tsar Nicolas II (Gill et al., 1994; Akane et al., 1992).


Migrations et démographie

 

  • Relations des Amérindiens avec l'Asie du nord-est: une délétion de 9 pb de la région V de l'ADNmt caractéristique de 20% des asiatiques et de quelques amérindiens se retrouve chez 6% des 67 squelettes d'un même cimetière d'Amérique du Nord vieux de 7000 ans (Stone 1992), dans une des 11 momies amérindiennes testées par Horai et al (1991) où une vingtaine de japonais et 11 momies provenant du Chili et SO des Etats-Unis ont été comparées avec des populations amérindiennes actuelles. Cette délétion est absente dans les spécimens de Windover (Floride) du même âge (Pääbo et al., 1988; Hauswirth et al., 1994). Les specimens de Windover possèdent aussi une transition A->G dans la même région que l'on retrouve seulement chez un petit groupe de japonais (Rogan & Salvo, 1990). Tous ces résultats confirment les relations des Amérindiens avec l'Asie du Nord-Est. La population de Windover, par contre, étudiée également à travers d'autres séquences (Hauswirth et al., 1994: MHC-I, microsatellites; Lawlor et al., 1991: HLA), peut être considérée comme population singulière (Hauswirth et al., 1994).
  • Colonisation de l'Amérique: 4 lignées mitochondriales distinctes seraient responsables du peuplement précoce du continent américain (Torroni et al. 1993)

 

  • Analyse génétique d'ossements de sites polynésiens préhistoriques remet en cause l'hypothèse d'un peuplement des archipels de Polynésie par les descendants directs de proto-polynésiens ayant migré depuis les îles de l'Asie du SE jusqu'au Pacifique Central, il y a 2500 à 3600 ans: une occupation plus ancienne par des habitants des îles mélanésiennes voisines a été montrée (Hagelberg & Clegg, 1993)


Paléopathologie

 

  • Maladie de Lyme causée par les bactéries spirochètes Borrelia burgdorferi et transmise par des tiques Ixodes damnini: l'ADN de Borrelia a été trouvé dans des tiques desséchés ou conservés dans l'alcool depuis 1925, une génération avant la première description de la maladie (Persing et al., 1990)
  • Mise en évidence de l'existence de la tuberculose en Amérique du Sud à une époque précolombienne: certaines séquences spécifiques de Mycobacterium tuberculosis ont été amplifiées dans une momie péruvienne naturelle de 1000 ans (Salo et al., 1994)

 

  • ß-Thalassémie, dont la cause est une mutation du gène ß-globine, a été identifiée dans des restes squelettaires d'un enfant en Israël de la période Ottomane (Oppenheim et al.,1995)


Domestication des animaux
 

  • L'origine du lapin domestique et sa dispersion dans les îles méditerranéennes (Monnerot et al.1994)
  • Utilisation de la peau de chèvre pour les rouleaux parchemin de la mer morte: extraction de l'ADN à partir de fragments de ces rouleaux et comparaison avec les espèces modernes de la région a conduit à la reconnaissance de l'espèce de Capra utilisé pour le parchemin à l'époque; il s'agissait déjà d'une chèvre domestiquée (Bar-Gal et al., 1995)

 

Agriculture

  • Amplification de l'ADN génomique à partir de grains de maïs Zea mays mays provenant d'une tombe précolombienne; domestication du maïs semble avoir eut lieu il y a 7000 ans en Amérique Centrale à partir de la téosinte et d'autres espèces du maïs Zea mays; les races domestiques de maïs n'ont pas une origine unique mais dérivent de plusieurs populations ancestrales distinctes; (Goloubinoff et al. 1993)
  • Grains de blé (Tricticum sp.) afin d'examiner les interactions de populations préhistoriques (gène gluténine; Brown et al., 1994)
  • Radis noir Raphanus sativus (O'Donoghue et al., 1996)
  • Sorghum de l'Égypte (Deakin, W.J. et al., 1995)


Reconstruction phylogénétique

  • kiwi Apteryx haastii, Apteryx owenii, Apteryx australis (Cooper 1992)
  • canards (Anas laysanensis, Cooper, 1996)
  • lapins Oryctolagus cuniculus (Hardy et al., 1995)
  • tigre à dents de sabre Smilodon fatalis (Janczewski et al., 1992)


Espèces éteintes
 

  • Magnolia du Miocène (Golenberg 1994; Golenberg et al., 1990))
  • Arbre Hymenaea protera (Leguminoseae) (Poinar et al., 1993)
  • Cyprès (Taxodium) (Soltis et al., 1992)
  • Insectes dans l'ambre (DeSalle et al., 1992; Cano et al., 1992a et b, 1993)
  • Couagga (Equus quagga; Higuchi et al., 1984; 1987))
  • Loup marsupial de Tasmanie Thylacinus cynocephalus (Thomas et al., 1989)
  • Oiseaux Ratites: Moas (Anomalopteryx didiformis, Pachyornis elephantopus, Dnornis novelzealandiae, Megalopteryx didinus, Emeus crassus) (Cooper et al., 1992 et 1994)
  • Ours des cavernes Ursus speleus (Hänni et al., 1994)
  • Mammouth (Höss et al., 1994; Hagelberg et al., 1994; Johnson et al. 1985)
  • Tigre à dents de sabre Smilodon fatalis (Janczewsi et al., 1992)
  • Paresseux Mylodon darwinii (Höss et al., 1996)


Etude de la diversité intraspécifique

 

  • Baleines (Arnason & Gulberg, 1994; Milinkovitch et al., 1993)
  • Dipodomys panamintinus (kangourou rat) (Thomas et al., 1990)
  • Hairy-nosed wombat (Lasiorhinus krefftii) (Taylor et al., 1994)
  • Loup d'Ethiopie (Canis simensis) (Roy et al., 1994b)
  • Chien sauvage d'Afrique (Lycaon pictus) (Roy et al., 1994b)
  • Loup rougeCanis rufus (Roy et al., 1994b et c)

 

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