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La technique du marquage au BRDU

Fabien Galy

Méthodes de marquage de la prolifération cellulaire.

 

 

 

Incubation des cellules vivantes en présence d’un précurseur parqué d’ADN, qui s’incorpore exclusivement lors de la réplication de l’ADN, soit en phase S (3H-thymidine (détecté in vitro par comptage à scintillation, ou in vivo par autoradiographie), Bromo-desoxy-uridine BrdU (détecté par immunocytochimie grâce à un anticorps spécifique anti-BrdU)). Ce type de marquage peut fournir diverses informations selon le protocole expérimental choisi, étant donné que le cycle cellulaire dure en moyenne 16 à 24 heures :

 

¨      Si le prélèvement par rapport à la fixation de l ‘échantillon a lieu quelques heures après la première administration du nucléotide marqué, le marquage obtenu est un index de l’activité mitotique instantanée.

 

¨      Si le prélèvement par rapport à la fixation de l ‘échantillon est effectué au moins un jour après une administration ponctuelle du nucléotide marqué, on peut suivre le devenir des cellules néoformées par division ; notamment in vivo, on peut voir si la prolifération est suivie de migration des cellules filles. Si on attend suffisamment longtemps (quelques semaines), on peut déterminer le phénotype dans lequel les cellules-filles se différencient, en combinant le marquage immunocytochimique BrdU avec le marquage immunocytochimique d’un marqueur phénotypique (double immunocytochimie).

 

Limites de la méthode : à cause du mode semi-conservatif de la réplication de l’ADN, la dilution du marqueur le rend indétectable à partir de deux cycles de division. Pour pallier cette dilution, dans le cas de cellules à prolifération peu intense (c’est le cas des cellules souches de l’hippocampe de Mammifères adultes) on, peut renouveler l’administration de nucléotide marqué plusieurs fois de suite (sachant qu’in vivo, ce marqueur est éliminé au bout de deux heures) : on parle alors de marquage cumulatif.