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Dossociation et purification des motoneurones

Ecrit par Jean-Pierre Ternaux

DISSOCIATION


Au jour embryonnaire 14 ou 15 (stade E 14 et E 15) , les motoneurones spinaux et du tronc cérébral sont d'ores et déjà en place dans le tissu nerveux et présentent une amorce d'arborisation neuritique*. 

Sous loupe binoculaire et en conditions stériles (hotte à flux laminaire horizontale), la moelle épinière et le tronc cérébral peuvent être prélevés chez des fœtus de cet âge.

 Le tissu prélevé est débarrassé des méninges et les ganglions rachidiens sont délicatement éliminés.

Les moelles épinières et les tronc cérébraux sont sectionnés en petit fragments (environ 1 mm3) puis incubés dans un tampon phosphate de sodium (PBS) contenant de la trypsine et de la DNAse, en absence de calcium et de magnésium. Après 30 min d'incubation à température ambiante, le tissu est homogénéisé à l'aide d'une pipette Pasteur siliconnée (environ 4 à 5 aller retours). La suspension cellulaire résultante est centrifugée (10 min, 700 x g ). Le culot cellulaire est remis en suspension dans du PBS contenant de la DNase afin d'éliminer les filaments d'ADN  libérés par les cellules mortes. La suspension est à nouveau centrifugée (10 min, 700 x g) et le culot, après élimination du surnageant est repris dans une solution de Hanks (HBSS: Hanks Balanced Salt Solution).

 Cette première étape de dissociation permet d'obtenir une suspension cellulaire des différents types cellulaires contenus dans la moelle et le tronc cérébral: interneurones, motoneurones et cellules gliales.

 Les cellules dissociées enzymatiquement et mécaniquement se présentent sous forme de corps cellulaires de diamètres différents.

 Dans les conditions de dissociation, les prolongements neuritiques ont été sectionnés. Cependant, les cellules présentes dans la suspension, compte tenu de leur stade de prélèvement sont capables d'exprimer à nouveau des prolongements neuritiques.

* Aux stades précoces du développement des neurones, il n’est pas possible d’identifier l’axone et les dendrites sur des critères morphologiques. Le terme neurite est alors utilisé pour caractériser l’ensemble des prolongements issus du corps cellulaire.

 

image1Rpurif.jpg Prélévement et dissociation de la moelle épinière de rat embryonnaire (E15)Prélévement et dissociation de la moelle épinière de rat embryonnaire (E15)
Toutes les étapes de prélèvement et de dissociation sont réalisées dans des conditions stériles, dans une hotte à flux laminaire.

1. Les fœtus sont prélevés par césarienne. Le fœtus est placée dans une tampon phosphate de sodium dépourvu de calcium et de magnésium (PBS-). La moelle épinière est disséquée sous microscope, à l’aide de pinces fines.
2. La moelle est prélevée et transférée dans une boîte de Pétri contenant du PBS-. 7 à 10 moelle épinière embryonnaires sont disséquées. Les moelles sont débarrassées des méninges et des ganglions de racine dorsale.
3. les moelles sont transférées dans une boîte de Pétri contenant du PBS-.
4. les moelles sont sectionnées, à l’aide d’un scalpel, en fragment de tissu d’environ 1 mm3.
5. Les fragments de tissu sont transférés dans 10 ml d’une solution de PBS- contenant de la Trypsine et de la DNAse. Le tissu est incubé dans cette solution, à température ambiante, pendant 30 minutes.
6. Après dissociation enzymatique, les fragments de tissu sont dissociés mécaniquement à l’aide d’une pipette Pasteur siliconnée.
7. La suspension cellulaire est centrifugée à 700 X g, pendant 10 minutes.
8. Le culot de cellules est remis en suspension dans une solution de PBS-, contenant de la DNAse .
9. les cellules sont à nouveau centrifugées à 700 X g, pendant 10 minutes.
10 . Le culot est repris dans 3ml de Hanks Balanced Salts Solution (HBSS)et les cellules sont mises en suspension à l’aide d’une pipette Pasteur. A ce stade les cellules peuvent être reprise dans du milieu de culture (Dulbecco Modified Essential Medium , supplémenté avec F12 : DMEM / F12) , comptées sur une cellule de Malassez et mise en culture sur des lamelles de verre préalablement recouvertes de Poly-L-Lysine puis de laminine. Dans ces conditions, on obtiendra des cultures primaires de moelle épinière, contenant des cellules gliales, des interneurones et des motoneurones.
11 et 12. La suspension cellulaire est déposée sur un gradient de Nycodenz constitué de deux couches de 3ml, respectivement de densité 1,047 et 1,065. Le gradient est centrifugé, à 5 °C, pendant 30 minutes.
13. et 14.  La partie haute du gradient (3 premiers ml), contenant les motoneurones est prélevée. Le volume est complété à 10 ml avec du HBSS.
15. La suspension cellulaire est centrifugée à 1000 X g pendant 10 minutes.
16. Le culot est repris dans un faible volume de milieu de culture (500 µl). les motoneurones sont comptés (Cellule de Malassez) et le volume est ajusté pour déposer 5000 ou 10 000 cellules sur les lamelles de verre.
17. Les cultures sont maintenues dans un incubateur à 37 °C en présence de 5% de CO2.

 

PURIFICATION


Au stades embryonnaires précoces (E12 à E15) les motoneurones spinaux et du tronc cérébral peuvent être caractérisés et identifiés par un certain nombre de marqueurs morphologiques et biochimiques.

 Dans la population des cellules dissociées, les motoneurones correspondent aux cellules de plus grand diamètre.

Cette propriété peut être utilisée pour séparer la population des motoneurones de l'ensemble des cellules dissociées (moins de 5% de la population totale).

 L'utilisation des techniques d'immunohistochimie montre que les motoneurones expriment des marqueurs tels: la Neuronal Specific Enolase (NSE), l'acetylcholine (ACh) et ses enzymes de synthèse et de dégradation: Choline Acetyl Transférase (ChAT)  et Acetylcholine Estérase (AChE).

Par ailleurs, le motoneurone exprime, pendant la période embryonnaire, un marqueur précoce de développement: Islet I, et la membrane des motoneurones exprime une protéine réceptrice spécifique du Nerve Growth Factor (NGF): le récepteur à basse affinité pour le NGF. Il s’agit de la molécule p 75.

La présence de ce récepteur spécifique sur le motoneurone embryonnaire, qui n'est pas exprimé sur les interneurones et les cellules gliales, constitue un élément moléculaire de choix pour réaliser une immuno séparation des motoneurones.

Après dissociation enzymatique et mécanique du tissu spinal embryonnaire, un prélèvement de la suspension cellulaire est déposé sur une lamelle de verre. Les cellules sont fixées avec du paraformaladéhyde. On applique un premier anticorps dirigé contre la choline acétyl tranférase, enzyme de synthèse de l’acétylcholine. après rinçage, on utilise un second anticorps couplé à la peroydase. Seules les cellules de grand diamètre, les motoneurones,

image3Rpurif.jpg
Immunohistochimie de la choline acetyl transferase dans les cellules dissociées de la moelle embryonnaire de rat
Après dissociation enzymatique et mécanique du tissu spinal embryonnaire, un prélèvement de la suspension cellulaire est déposé sur une lamelle de verre. Les cellules sont fixées avec du paraformaladéhyde. On applique un premier anticorps dirigé contre la choline acétyl tranférase, enzyme de synthèse de l’acétylcholine. après rinçage, on utilise un second anticorps couplé à la peroydase. Seules les cellules de grand diamètre, les motoneurones, possèdent un marquage positif.
Echelle : 10 µm.