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Purification par gradient de densité

Ecrit par Jean-Pierre Ternaux

Cette technique a été mise au point par Martinou et al. (1989) et modifié par Bataillé et al. (1999). Elle consiste, brièvement à déposer les cellules dissociées sur un gradient de Nycodenz constitué de deux couches de densités différentes.

Au fond du tube de centrifugation on dépose 3 ml d'une solution de Nycodenz de densité 1,065, puis délicatement 3 ml d'une solution de Nycodenz de densité 1,047, 2 ml de la suspension de cellules dissociées (densité 1) sont déposées au sommet du gradient.

 Le gradient est centrifugé pendant 20 min  à 700 x g dans une centrifugeuse refroidie à 4°C .

Dans ces conditions de centrifugation, les cellules de grand diamètre (les motoneurones) migrent à l'interface entre la couche de densité 1 et  celle de densité 1,047, alors que les cellules de plus faible diamètre atteignent l'interface entre la couche de densité 1,047 et celle de densité 1,065.

 Les débris et les hématies s'accumulent en culot au fond du tube. La fraction correspondant aux motoneurones est prélevée à l'aide d'une micropipette. Les cellules sont mises en suspension dans une solution de HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) et centrifugées, à nouveau (10 min, 1000 x g). Après élimination du surnageant, le culot est repris dans un milieu de culture défini.

L'identification des motoneurones purifiés peut être attestée par la mise en œuvre de différentes méthodes.

Le prélèvement du gradient de centrifugation, ml par ml, du haut vers le bas du tube permet l'analyse de divers paramètres pour chaque fraction prélevée.

La fraction contenant les motoneurones présente des cellules de grand diamètre relativement homogène alors que la fraction des cellules gliales et des interneurones est caractérisée par des cellules de diamètres plus faibles.

Le nombre de cellules déterminé dans chaque fraction montre que la population des motoneurones est beaucoup plus faible que celle des interneurones et des cellules gliales et correspond à la proportion du nombre de motoneurones par rapport à la population totale de cellules dénombrée in vivo.

 La mesure des taux endogènes d'ACh avec la méthode de chimiluminescence montre sans ambiguïté que les plus grandes concentrations d'ACh  sont détectées au niveau de la fraction correspondant aux motoneurones.

 Enfin la mise en œuvre des techniques d'immunocytochimie utilisant respectivement des anticorps dirigés contre l'ACh, la ChAT, l'AChE et Islet I, montre que l'ensemble de la population des cellules de grand diamètre sont  immuno positives pour ces marqueurs.

 

image1Rdens.jpg
Caractéristiques des cellules purifiées par gradient de Nycodenz

Après centrifugation du gradient de Nyodenz, les cellules sont dispersées tout au long du gradient avec cependant deux zones spécifiques:  à l’interface entre les couches de densité 1, 0 et 1, 047 et à l’interface entre les couches de densité 1, 047 et 1, 065. La première zone contient les cellules de grand diamètre, les motoneurones. La seconde zone, plus basse dans le gradient contient des cellules de diamètre plus petit, correspondant aux interneurones et aux cellules gliales.

 

image3densR.jpg image5Rdens.jpg
image7Rdens.jpg L’analyse des caractéristiques des cellules est réalisée en prélevant le gradient ml par ml (8 fractions).

 Un comptage du nombre des cellules est effectué dans chaque fraction. On peut observer que le nombre de cellules est beaucoup plus élevé dans la partie basse du gradient, ce qui correspond aux cellules gliales et aux interneurones.

Le nombre de cellules de grand diamètre, observées dans la fraction haute du gradient ramené au nombre total de cellules présentes dans l’ensemble du gradient, correspond à 3 à 5 % de la population totale de cellules. Cette valeur correspond au pourcentage de motoneurones présent « in vivo » dans le tissu spinal. Chaque fraction est également analysée pour son contenu endogène en acétylcholine (technique de chimiluminescence). On peut observer que les plus grandes concentrations d’acétylcholine sont détectées au niveau des fractions contenant les cellules de grand diamètres, c’est à dire les motoneurones.