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Outils de la biologie moléculaire
Mise à jour : 14/08/2001
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Les désoxyribonucléases

Plusieurs types d'enzymes (nucléases) catalysent l'hydrolyse des acides nucléiques : 

  • les endonucléases : coupent à l'intérieur de l'acide nucléique.
  • les exonucléases : dégradent la molécule en détachant les nucléotides successivement à partir d'une extrémité. Ex : Exonucléase III, Nucléase Bal 31.
N'est développé ici le que le cas des endonucléases largement utilisées en biologie moléculaire :
Endonucléases de restriction, Désoxyribonucléase I (DNAse I), Nucléase S1
 
Endonucléases 
de restriction :
(enzymes de restriction)		 Activité : reconnaître une séquence définie de l'ADN (site de reconnaissance, ~4 à 8 bases) et couper dans ou à proximité de cette séquence.

Caractéristiques : 

  • Nomenclature : 1ère lettre=espèce bactérienne dont elle est extraite / 2-3ème lettre=genre de l'espèce / 4ème lettre=souche bact. / chiffre romain=ordre de découverte de l'enzyme.

    • Ex:EcoRI
     
  • Les types d'enzymes

    • Type I : site de reconnaissance dissymétrique ; coupure à ~1000 bases plus loin.Cartographie.
    Ex : EcoB TGAN8TGCT

    Type II : les + utilisées. Site de reconnaissance palyndromique. Coupure souvent dans le site reconnu ou à proximité immédiate. Cartographie + clonage.
    Ex :EcoRI Schéma

    Type III : ~type I mais coupure à une dizaine de nucléotides du site de reconnaissance. Cartographie.
    Ex : FokI
     

  • Types de coupure engendrée 

    • Bouts francs (blunt end) :
    Ex : SmaI Schéma    		 Bouts cohésifs (sticky end) :
    Ex : EcoRI avec un bout 5'sortant
    Ex : DpnI avec un bout 3'sortant 
    Schéma
     
  • Quelques enzymes reconnaissent la même séquence = isoschizomère. Mais ne catalysent pas obligatoirement le même type de coupure, peuvent avoir des sensibilités à la méthylation , des conditions de réaction différentes.

    • Ex : HpaII / MspI
     
  • sensibilité à la méthylation :

    • l'activité de certaines enzymes est inhibée par la méthylation d'une base du site de reconnaissance.

    Ex : HpaII ne coupe pas si CCGG méthylé.On peut ainsi prédire si le site est méthylé ou non selon la provenance de l'ADN. En effet, les C sont méthylées dans certains doublets CG chez les Mammifères donc non coupés par HpaII, alors que tous les sites d'un ADN procaryote seront coupés. Pour couper tous les sites ADN eucaryotes, utiliser MspI non sensible à la méthylation et isoschyzomère de HpaII.

    Utilisation :

  • cartographie des gènes.
  • clonage.
    		•
    Désoxyribonucléase I (DNAse I) : Activité : couper l'ADN simple brin ou double brin de préférence après une base pyrimidique, sur un ou les deux brins selon l'ion divalent du tampon (Mg2+ ou Mn2+). Utilisation :
  • analyse des gènes actifs de la chromatine (in vivo).
  • élimination de l'ADN contaminant de préparations d'ARN ou protéiques.
  • marquage par translation de coupure.
    		•
    Nucléase S1 Activité : dégrader spécifiquement les acides nucléiques simple brin. Utilisation :
  • étude des hybrides ADN-ARN pour détecter des introns.Schéma
  • conversion des bouts cohésifs en bouts francs pour le clonage.
  •  suppression des boucles dans la synthèse des ADNc.
    		•
    Institut national de recherche pédagogique