Les électrophorèses

L'emploi de l'électrophorèse classique est quotidien aussi bien à des fins analytiques que préparatives. Pour l'analyse d'échantillons d'ADN, l'électrophorèse en champ pulsé est utilisée.
 

Principe général de l'électrophorèse analytique Les acides nucléiques sont des macromolécules polyanioniques uniformément chargées. De ce fait sous l'effet d'un champ électrique ils peuvent migrer sur un support solide, un gel et être séparés. La charge relative étant constante, le système de discrimination entre les molécules est l'effet de filtration du gel utilisé. Suivant les théories de l'électrophorèse, la mobilté u dans un champ électrique au sein d'un gel est :  Log u = Log uo - Kr C Avec Log uo = mobilité de la molécule en milieu liquide ; Kr= coefficient de retardement dû au gel, fonction de la masse moléculaire de la molécule ; C = concentration du gel   Nous constatons que la vitesse de migration d'une molécule d'acide nucléique sera fonction :  - de sa masse moléculaire donc du nombre de bases (ou de paires de bases). Plus une molécule sera de faible masse moléculaire, plus sa vitesse de migration sera grande.- de la concentration d'acrylamide ou d'agarose du gel. La séparation d'un mélange d'acides nucléiques donné est fonction : - du choix de la nature du support de l'électrophorèse (gel d'agarose ou polyacrylamide) -du diamètre des pores du gel utilisé dépendant de la concentration du gel. Choix du support :-le gel d'agarose : support le plus utilisé.Les tailles de fragments qu'il est possible de séparer sont comprises entre 0,5 et 20 kb.Les gels sont coulés à l'horizontale dans des appareils transparents aux UV de manière à pouvoir suivre périodiquement la migration. La migration est horizontale.-le gel de polyacrylamide :utilisé pour la séparation des petits fragments cad de moins de 1000 pb. Le gel est coulé entre deux plaques de verre à l'abri de l'oxygène. La migration est verticale.Ses utilisations majeures :  purifier des oligonucléotides de synthèse et éliminer des nucléotides libres après leur marquage radioactifdéterminer des séquences d'ADN.séparer des petits fragments d'ADN Visualisation des acides nucléiques : par coloration du gel au bromure d'éthidium (BrEt) qui est un agent s'intercalant entre les plateaux de paires de bases et émettant une fluorescence orange lorsqu'il est éclairé par des UV courts (200-300nm). Le seuil de détection est de qq ng.La comparaison visuelle de la fluorescence d'un échantillon avec celle d'une quantité d'ADN connue (le marqueur de taille) permet d'estimer la quantité d'acides nucléiques déposée.détermination de la taille d'un fragment : se fait par rapport à la migration d'un marqueur approprié contenant des fragments de tailles connues. Schéma du principe Remarque : l'électrophorèse permet aussi de séparer des molécules d'acides nucléiques suivant leur structure ( ex : les différentes formes d'un plasmide)  Electrophorèse des ARN : les ARN sont le plus souvent des molécules de taille importante  (> 0,8kb) ; les gels utilisés seront donc d'agarose, autoclavés. Ils forment souvent des structures secondaires assez stables qui perturbent la migration électrophorétique et faussent l'estimation du poids moléculaire. Alors les gels utilisés contiennent des agents dénaturants (ex : formaldéhyde) qui déstabilisent les appariements entre bases.

L'électrophorèse en champ pulsé : Pour séparer des fragments de taille supérieure à 20 kb. Le principe de cette électrophorèse consiste à changer l'orientation et/ou la polarité du champ électrique alternativement au cours du temps.A chaque modification du champ, la molécule d'ADN doit se réorienter parallèlement au nouveau champ. Le temps nécessaire à la réorientation est proportionnel à la longueur de la molécule. Lorsque le champ est rétabli dans son sens initial, la molécule doit une nouvelle fois se réorienter.Ces temps de réorientation provoquent un retardement de la migration nette qui est proportionnel à la taille de la molécule.Le support de migration est un gel d'agarose à 1% et la taille des fragments séparés est de l'ordre de 50 kb à qq mégabases. Il n'est pas possible d'utiliser les méthodes classiques pour analyser des échantillons d'ADN (longueur environ 50 kb). Aussi les cellules dont on souhaite analyser l'ADN sont incluses dans un bloc d'agarose et la digestion par les enzymes de restriction est effectuée in situ. Puis on utilise le principe de l'electrophorèse en champ pulsé.

Electrophorèse préparative : Les principes et conditions techniques sont identiques à ceux de l'électrophorèse analytique. Après migration, on repère les bandes correspondant à l'acide nucléique à purifier. Pour récupérer l'échantillon :  la bande est découpée et l'acide nucléique est obtenu après diffusion dans un tampon adéquat. un petit puits est découpé en avant de la bande d'ADN à purifier, puis rempli de tampon et le courant est rebranché.L'ADN migre dans le puits. Il est récupéré à la pipette.