Techniques 
Techniques de biologie moléculaire
Mise à jour : 14/08/2001
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L'extraction des acides nucléiques

Précautions

  •  la préparation d'ARN est plus délicate que celle d'ADN car les ribonucléases (RNAses) sont très répandues (par ex. sur les doigts) et sont fréquemment capables de se renaturer après de nombreux traitements (même la dénaturation par la chaleur).
  • les contaminations sont minimisées par le port de gants, l'utilisation de vaisselle et de solutions stériles et/ou traitées au DEPC (agent inhibiteur des RNAses).
De l'ADN
De l'ARN
A partir du sang
 
  • faire éclater les globules rouges du sang par choc osmotique en le mélangeant à une solution hypotonique
  •  récupérer des globules blancs par centrifugation
  •  ajouter un mélange de détergent (SDS ou Sarcosyl) et de protéinase K ; le détergent détruira les membranes et la protéinase digérera les protéines associées à l'ADN
  •  extraire l'ADN des protéines par un mélange phénol-chloroforme 
  •  ajouter des sels pour augmenter la force ionique puis précipitation de l'ADN par l'alcool éthylique absolu froid (-20°C).

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    L'ADN précipite sous forme de filaments, visibles à l'oeil nu, qui sont récupérés par enroulement sur une baguette de verre.

  •  redissoudre l'ADN dans une solution tamponnée. L'ADN peut être ainsi conservée à 4°C plus d'un an.

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    Remarque : la taille des fragments engendrés par les cassures mécaniques au cours de cette extraction est supérieure à 20kB. Le rendement de cette méthode est de quelques centaines de microgrammes d'ADN pour 10 à 20 ml de sang.

    Attention : éviter de congeler l'ADN génomique, la congélation provoquant de nombreuses cassures de la molécule.

    		 Extraire des ARN totaux
    La méthode la plus sûre est la m. de Chirgwin (extraction d'ARN à partir de pancréas, tissu très riche en RNAses).
     
  • broyer le tissu dans un homogénéisateur de Potter avec une solution adéquate (détergent SDS ou Sarcosyl + un agent dissociant + une solution tampon + un agent réducteur)
  •  centrifuger l'homogénat pour éliminer les débris cellulaires.

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  • L'extraction des ARN se fait : soit par précipitation différentielle de l'ARN et de l'ADN / soit par ultracentrifugation sur coussin de chlorure de césium (seul l'ARN peut, vue sa densité, traverser ce coussin et être récupéré dans le culot

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  •  laver l'ARN dans l'acétate de sodium et précipiter à l'alcool
  •  l'ARN peut être conservé plus d'un an soit sous forme précipitée dans l'éthanol, soit sous forme congelée à -80°C . 

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    A partir de tissus ou cellules en culture
    Les sources cellulaires : des biopsies (ex : de villosités choriales lors d'un diagnostic prénatal) ou cultures de cellules. Les cellules doivent préalablement être dissociées et homogénéisées lors du passage du tissu dans un homogénéisateur de Potter en présence de détergent. Le protocole est ensuite identique que ci-dessus.    		 purifier les ARNm à partir de ARN totaux

    La majorité des ARNm eucaryotes possèdent une queue polyadénylée (polyA) à son extrémité 3', utilisée pour purifier les ARNm par affinité.
     

  • passer la solution d'ARN sur une colonne d'affinité dont les sites de fixation sont des oligonucléotides polydT ou polyU
  •  Les ARN polyA sont retenus alors que les ARNt et ARNr non
  •  éluer les ARNm et les récupérer par précipitation par l'alcool éthylique absolu froid. On obtient ~50%d'ARN non polyA
  •  pour enrichir en ARN polyA, repasser sur la colonne.
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    Institut national de recherche pédagogique