Transfert d'ADN sur membrane

Les ADN séparés sur un gel peuvent servir de base à d'autres études. Pour une manipulation plus aisée, il est nécessaire de transférer le matériel nucléique contenu dans le gel sur un support (à base de nitrocellulose ou de nylon) relativement inerte. Préalablement à la phase de transfert proprement dite il faut traiter le gel pour dénaturer l'ADN et faciliter sa sortie du réseau d'agarose.

Traitement du gel :

Le gel passe dans trois bains :

- premier bain : 15 minute dans de l'acide chlorhydrique 0,25 mol.L^-1. L'acide doit couper la liaison entre deux base puriques successives, ce qui diminue la taille de l'ADN et facilite la transfert sue l membrane.

- deuxième bain : 30 minutes dans une solution de NaOH NaCL de concentrations finales respectives 0,5 mol.L^-1 et 1,5 mol L^-1. Ce bain a pour but de dénaturer l'ADN qui devient donc simple brin.

- troisième bain : 30 minutes dans de l'acétate de sodium à 3 mol.L^-1 (pH 5,5). Ce bain sert à neutraliser le gel pour éviter toute réactivité de la membrane du point de vue acido-basique.

Montage du transfert :

* *Remarque : ne pas toucher les membranes avec les doigts, les manipuler avec des pinces "Millipore".

- Découper : 1 membrane de la taille du gel exactement et faire un repère de latéralité - 4 papiers 3M de la taille du gel exactement - 2 papiers 3M de 5 cm plus grand que le gel - 1 couche bébé en deux morceaux.

- Installer une plaque de verre sur la paillasse.

- Déposer sur la plaque : 

les 2 grands papiers 3M (imbibés de SSC 20X)

le gel traité

la membrane (**)

les 4 papiers 3M de la taille du gel

les deux demi couche bébé

une plaque de verre

un poids de 1 kg

- Laisser ce montage en place pendant 3 heures minimum,ou mieux, la nuit.

Démontage :

- Enlever les papiers et les couches.

- Récupérer la membrane avec les précautions voulues.