Révélation de l'hybridation

- Rincer les membranes 5 minutes dans 20 mL de tampon 1.

- Incuber 30 minutes dans 100 mL de tampon 2 (état de blocage).

 
• Diluer au 1/10000 10µL de solution d'anticorps anti-digoxigenein/AP dans la solution tampon 2.

- Incuber les membranes 30 minutes dans 20 mL de solution d'anticorps diluée.

- Rincer 2 fois 15 minutes dans 100 mL de tampon 1 (pour fixer les anticorps).

- Equilibrer 5 minutes dans le tampon 3.

 
• Diluer au 1/100 0,5 mL de solution mère d'AMPPD dans 50 mL de tampon 3.

- Rincer les membranes 5 minutes dans 10 mL de solution diluée d'AMPPD (le photons commencent à émettre sur le filtre) 

- Récupérer la solution.

- Eponger rapidement les membranes sur papier 3M ; ne pas les dessécher.

- Sceller chaque membrane dans un sac en plastique.

- Incuber les membranes 15 minutes à 37°C (pour que la réaction phosphatase alcaline se fasse).

Exposition 30 minutes minimum, puis révélation.

 
• une solution pour toute la salle à préparer au dernier moment, garder au froid et à l'abri de la lumière.

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Solution tampon 1 : acide maléique 0,1M,  NaCl 0,15M, pH 7,5, tween 20 0,3%

Solution tampon 2 : acide maléique 0,1M, NaCl 0,15 M, pH 7,5, réactif de blocage 1%

Solution tampon 3 : Tris-HCl 0,1M, NaCl 0,1M, MgCl₂ 50 mM, pH 9,5