Marquage de l'ADN et purification

- Linéariser l'ADN (digestion enzymatique), prélever 4µL (50 ng.µL^-1).

- Dénaturer 10 minutes à 95°C puis refroidir rapidement dans la glace (pour éviter la renaturation).

- Ajouter 2µL de mélange d'hexanucléotides et 2µL de mélange de dNTP (dNTP = mélange de 4 désoxyriboses triphosphates dont dUTP marqué à la dégoxygénine).

- Compléter le volume à 19 µL avec de l'eau stérile.

- Ajouter 1µL d'enzyme Klenow - ADN polymérase - (ne pas sortir le tube de la glace).

- Centrifuger brièvement.

- Laisser incuber une nuit à 37°C.

Purification par tamisage moléculaire : 

- Ajouter 5µL de solution d'EDTA 0,2M + bleu de bromophénol + bleu de dextran.

- Prendre une pipette Pasteur et couper son extrémité.

- Disposer de la laine de verre à l'intérieur afin de remplir le rétrécissement.

- Remplir cette colonne de 50 mL de Sephadex G75.

- Equilibrer avec du TE.

- Mettre l'ADN à purifier sur la colonne et éluer avec du TE.

- Collecter des fractions de 4 gouttes.

Purification par précipitation :

- Ajouter 2,5 µL de LiCl 4M, agiter. Ajouter 75 µL d'éthanol à -20°C. Agiter.

- Laisser 2 heures à -20°C ou 30 minutes à -70°C.

- Centrifuger à 12000g. Laver le culot avec de l'éthanol 70% à -20°C.

- Sécher sous vide (20 minutes).

- Dissoudre à 37°C dans 50µL de tampon TE ou H₂O.