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Matériel et méthode.
La cytométrie en flux est une technique de détermination de caractéristiques cellulaires (marqueurs membranaires, réplication, quantité d'ADN...). Plusieurs caractères peuvent être déterminés simultanément par l'utilisation de fluorochromes différents (émission dans des longueurs d'onde différentes) associés à des anticorps de spécificité différentes.
L'analyse de chaque cellule permet de distinguer des populations cellulaires présentant des fluorescences différentes. Cette analyse peut être suivie d'un tri. L'analyse statistique des données cytométriques réalisées à des intervales de temps réguliers permet de suivre l'évolution des populations cellulaires (cycle cellulaire, populations lymphocytaires pour le SIDA ...)
Conditions de culture :
- Incubation des cellules pendant 30 minutes en présence de bromodésoxyuridine (BrdUrd).
- Prélèvement des cellules toutes les heures.
Incubation des cellules en présence de iodure de propidium (PI) et d’anticorps anti-BrdUrd après chaque prélèvement.
- Le BrdUrd est utilisé comme précurseur par les cellules lors de la synthèse de l’ADN.
- Le PI est un marqueur se fixant à l’ADN. La quantité de PI fixé est proportionnelle à la quantité d’ADN cellulaire.
- FL2-A correspond au PI.
- FL1-H correspond au BrdUrd.
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| abrdu001
abrdu002 abrdu003 abrdu004 abrdu005 abrdu006 abrdu007 abrdu008 abrdu009 |
Ces différents fichiers correspondent à
des acquisitions réalisées à des temps croissants
de prélèvement après incubation en présence
de BrdUrd.
Le fichier abrdu006, par exemple, correspond à des cellules prélevées 6 heures après l'incubation. |
| Présentation générale
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| Analyse d'un cycle cellulaire |
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La superposition des différents
dot plot permet de suivre l'évolution de la quantité d'ADN
pour une même population cellulaire ayant incorporée x quantité
de BrdU pendant l'incubation.
Ces cellules auront réalisé un cycle complet lorsqu'elles seront revunu à la quantité initiale d'ADN. Ayant subi la mitose, ces cellules vont présenter x/2 quantité de BrdU. Dans le cas des cellules de Hamster chinois, on aboutit à un cycle d'une durée approximative de 7 heures. |
Activité possible avec les élèves
Activité 1 : Les différentes
étapes du cycle cellulaire
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| Ouvrir le fichier abrdu001 afin de faire apparaître sur un dot plot la quantité d'ADN en abscisse et la quantité de BrdUrd en ordonnée | 1a - Combien de populations cellulaires n'ont pas incorporé
le BrdUrd ?
1b - Dénombrer les cellules dans chacune de ces populations après les avoir délimitées. 1c - Comparer la quantité d'ADN dans chacune de ces populations et préciser celles qui viennent de subir la mitose et celles qui vont la subir. 2a - Quantifier les cellules ayant incorporé le BrdUrd 2b - Commenter la quantité d'ADN des cellules ayant incorporé le BrdUrd. 2c - Expliquer pourquoi des cellules qui ont incorporé la même quantité de BrdUrd peuvent posséder des quantité différentes d'ADN . Parmi ces cellules, localiser celles qui sont en début et en fin de synthèse d'ADN. 3 - Placer sur le cycle cellulaire les différentes populations cellulaires caractérisées dans les questions précédentes.
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Activité 2 : Evolution de la quantité
d'ADN au cours d'un cycle cellulaire
| Ouvrir les fichiers permettant de suivre l’évolution de la quantité d’ADN au cours du temps. (ABRDU001 à ABRDU009) | 1 - Repérer sur le dot plot à t=1 heure les cellules
ayant une quantité Q d'ADN et ayant incorporé une quantité
maximale de BrdU. Quantifier l'ADN de ces cellules sur les autres dot plot.
2 - Construire une courbe de l'évolution de la quantité d’ADN cellulaire au cours du temps en suivant la population cellulaire repérée dans la question 1. |