La fécondation in vitro avec micro-injection ou ICSI (Intra cytoplasmic injection) n'utilise qu'un seul spermatozoïde qui est introduit dans le cytoplasme ovulaire avec une micropipette. 
 

Étape	Particularité de la procédure dans le cadre de l'ICSI par rapport à une FIV classique
Maturation folliculaire	l'ICSI est toujours conduite en cycle stimulé, afin d'obtenir si possible cinq ovocytes ou plus.
Recueil et préparation des gamètes	après la ponction des ovocytes ces derniers sont décoronisés, c'est-à-dire débarrassés du cumulus et des cellules de la granulosa par pipettage après exposition à la hyaluronidase. Les ovocytes une fois décoronisés sont placés dans une étuve à 37°C sous atmosphère de 5% de CO2 dans l'air. Seuls les ovocytes mûrs (ovocytes en métaphase II ayant émis leur second globule polaire) sont immédiatement micro-injectables. Les spermatozoïdes, frais ou congelés, de toute origine (éjaculat, prélèvement chirurgical) pourvu qu'ils soient vivants, sont placés dans une solution de poly-vinyl pyrrolidone (PVP) qui les immobilise par sa viscosité. Un seul spermatozoïde mobile est chargé dans la micropipette, après cassure du flagelle pour lui enlever toute possibilité de mouvement à l'intérieur du cytoplasme ovulaire. L'ICSI peut aussi être réalisée avec des spermatides prélevées dans le testicule à divers stades de leur développement.
Micro-injection et culture embryonnaire	La micro-injection est réalisée à l'aide d'un micro-manipulateur qui comprend deux bras : l'un tient une pipette de contention qui sert à immobiliser l'ovocyte par aspiration contre son extrémité mousse ; l'autre tient la micro-pipette de ponction. La micro-pipette, chargée d'un seul spermatozoïde, est introduite dans le cytoplasme ovulaire, qui est aspiré en partie pour vérifier la pénétration, puis refoulé à sa place en même temps que le spermatozoïde. La préparation est remise à l'étuve. Dix-sept heures plus tard, un nouvel examen permet de repérer les deux pronuclei, l'un des noyaux étant celui de l'ovocyte, l'autre correspondant à la tête du spermatozoïde injecté.