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Dénombrement des microorganismes revivifiables par incorporation en gélose

par lhuillier R.Cadet JM.Coulais S.Dief JM.Greffion H.Laboulle T.Lhuillier S. Le Poezat JL.Martin G.Pallier last modified 2010 Apr 26 13:20

  
Dernière mise à jour : 6 mai 1999


Objectifs

Evaluer la qualité bactériologique d'une eau. L'absence de micro-organismes dans une eau peut s'interpréter de deux manières : eau protégée des sources de contamination ou présence d'éléments toxiques ayant entraîné leur disparition. La présence d'une quantité importante de micro-organismes révèle l'existence d'une contamination dont il faut rechercher les causes et les éléments.

Informations

  • Nature des micro-organismes : bactéries, levures, moisissures se développant en aérobiose à 37°C +/- 1°C.
  • Norme : pour les eaux livrées sous forme conditionnée, le nombre de micro-organismes doit être inférieur à 20/mL après 24 heures de culture, inférieur ou égal à 200/mL après 72 heures.
  • Effets sur la santé : ils dépendent des espèces de bactéries présentes dans l'eau et de leur nombre.

Principe de la mesure

  • Mise en culture sur une gélose nutritive d'un d'échantillon d'eau d'un volume de 1 mL et comptage des colonies après incubation à 37°C pendant 24 à 72 h.

Matériel

  • Stérilisation : four (température minimale de 170°C) ; autoclave ; cocotte minute.
  • Etuve ou enceinte thermostatée 37°C +/- 1°C.
  • Matériel de microbiologie : boites de pétri stériles, pipettes 1 mL stériles (usage unique), flacons stériles, gélose PCA (Plate Count Agar), tubes à bouchon vissant contenant 9 mL d'eau stérile.

Protocole

  • Préparation de la gélose et conservation :
    • Suivre les indications fournies avec la gélose PCA et stériliser en flacons de 100 mL à 200 mL.
    • Laisser cette gélose en surfusion dans une étuve à 47°C si le TP est prévu dans la semaine. Sinon conserver la gélose au réfrigérateur, la mettre en fusion au four ou au bain marie bouillant quelques heures avant le TP.
  • Stérilisation des flacons de prélèvement
    • Mettre du coton cardé (hydrophobe) sur l'embouchure, recouvrir de papier aluminium.
    • Stériliser (au four à 170°C pendant 1 heure ; à l'autoclave à 120°C pendant 20 min ; dans une cocotte minute contenant un peu d'eau pendant 40 minutes après la mise en rotation de la soupape).
  • Prélèvement :
    • Eau de rivière, de puits, etc. : attacher la bouteille stérile à une corde, lester. Maintenir la bouteille dans l'eau à la profondeur souhaitée. Boucher avec le coton cardé conservé dans le papier aluminium.
    • Eau du robinet : nettoyer le robinet avec un tissu propre, laisser couler l'eau pendant 1 à 2 min. Stériliser à la flamme (briquet, lampe alcool) l'embouchure du robinet, laisser couler l'eau pendant 1 à 2 min. Remplir le flacon en laissant un peu  d'air. Boucher avec le coton cardé conservé dans le papier aluminium.Conserver l'échantillon au réfrigérateur, ensemencer le plus vite possible.
  • Ensemencement :
    • Préparer une zone stérile en plaçant autour du bec bunsen le matériel nécessaire : boites de pétri, pipettes stériles, gélose en surfusion…
    • Agiter le flacon vigoureusement et prélever 1 mL d'échantillon. Si l'échantillon provient d'un milieu qui semble contaminé, réaliser des dilutions en série en zone stérile. Mettre 1mL d'échantillon d'eau dans un tube à essai contenant 9 mL d'eau stérile (dilution au 1/10). Agiter ce tube, y prélever 1 mL et verser dans un autre tube contenant 9 mL d'eau stérile (dilution au 1/100). Etiqueter le fond des boites de pétri : lieu de prélèvement, dilution…
    • Mise en culture. En zone stérile, verser 1 mL d'échantillon dans une boite de pétri, répartir au fond de la boite par gouttes. Couler la gélose en surfusion (5 mm d'épaisseur suffisent). Mélanger par rotation, mettre le couvercle entrouvert, et laisser solidifier en zone stérile. Si l'échantillon semble contaminé, faire plusieurs ensemencements à des dilutions différentes : 1/1, 1/10, 1/100.
  • Incubation
    • Placer les boites à l'étuve à 37°C (incuber les boîtes couvercle vers le bas pour que la condensation s'accumule dans le couvercle) .
    • Retirer 22 à 24 heures après. Conserver au réfrigérateur.

Résultats

  • Dénombrement
    • Le dénombrement des bactéries repose sur le principe selon lequel une colonie se forme par divisions d'un seul micro-organisme.
    • Compter les colonies en marquant chaque colonie sur le fond de la boîte avec un marqueur indélébile.
    • Pour des raisons de sécurité, ne jamais ouvrir la boîte.
  • Lisibilité des résultats
    • Une boite est considérée comme lisible si la population est inférieure à 300 colonies. Sinon, effectuer le comptage sur une boite où l'échantillon a été dilué.
    • En cas de dilution, une boite est considérée comme lisible si elle contient au moins 1 colonie.
  • Nombre de bactéries par mL
    • Calculer la population par mL en tenant compte de la dilution.

Décontamination

  • Ouvrir les boites au laboratoire, les décontaminer à l'autoclave 120°C pendant 20 minutes ou dans l'eau de Javel diluée (un berlingot de 250 mL complété à 1 L avec de l'eau distillée) pendant 24 heures.

 

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