Dossiers

Dosage des acides nucléiques :Il est rarement nécessaire d'effectuer un dosage très précis et dans la pratique une simple estimation de la concentration suffit.

Elle est effectuée par photométrie (spectrophotométrie), les bases puriques et purimidiques absorbant fortement dans l'ultraviolet à 260 nm.

Une unité de densité optique à 260 nm (DO lue sur le spectrophotomètre) correspond à :

ADN double brin à 50 microg/ml

ARN ou d'ADN simple brin à 25 microg/ml

(attention ces valeurs s'appliquent à des acides nucléiques parfaitement purs et en solution homogène)

Aussi il convient de rechercher une éventuelle contamination protéique car les protéines absorbent non seulement à 280 nm mais aussi à 260 nm. Pour cette raison on effectue une seconde mesure de DO à 280 nm. Un ADN pur doit avoir un rapport DO 260 / DO 280 compris entre 1,8 et 2.Une éventuelle contamination par du phénol peut être recherchée en mesurant l'absorption à 270 nm.

Remarque : l'ADN peut aussi être dosé avec plus de sensibilité et de spécificité par fluorimétrie après coloration par un produit spécifique. L'électrophorèse sur gel et coloration au bromure d'éthidium est souvent utilisée.

Conservation des acides nucléiques :

L'ADN : peut être conservé dans un tampon (10mM Tris pH=8) additionné d'EDTA (1mM) à 4°C. A pH 8, la dégradation de l'ADN est notablement plus faible qu'à pH 7. L'EDTA permet de chélater les ions divalents (nécessaires pour les nucléases) et évitent la croissance de microorganismes. L'ADN peut être également conservé à -20°C dans le même tampon mais des cycles successifs de congélation/décongélation entraînent des cassures des acides nucléiques de grande taille (>10kb).
L'ARN : même type de conservation que pour l'ADN mais les échantillons sont stockés à -80°C après addition de 3 vol d'éthanol. En l'absence de sels, ils restent en solution. Une aliquote représentative peut être prélevée après agitation puis ajustée à 0,3M d'acétate de sodium pH 5,2 brièvement à -20°C et collectée par centrifugation.