I - Technique du transfert nucléaire
 

Diaporama résumant les différentes étapes du transfert d'un noyau de cellule embryonnaire dans un ovocyte de bovin : Enucléation (photos 1 à 4) Prélèvement de cellule embryonnaire (photos 5 et 6) Introdcution de la cellules donneuse sous la zone pellucide (photo 7) Fusion de l'ovocyte avec la cellule donneuse (photo 8) Développement de l'embryon (photo 9 à 11) Jeunes veaux clonés obtenus après transfert des embryons dans des vaches porteuses (photo 12) Photos P. Chesné (INRA Jouy en Josas)

Détails des étapes

Enucléation de l'ovocyte
 

Pipette de contention (aspiration légère) sur la gauche, Ovocyte en métaphase II (GP1 visible) et pipette d'énucléation sur la droite.	La pipette fine traverse la zone pellucide et aspire le noyau de l'ovocyte, le GP1 et une certaine quantité de cytoplasme.	Pipette d'aspiration ressortie, trace de passage visible dans la zone pellucide, volume de l'ovocyte diminué.	Coloration de Hoechst permettant de visualiser le noyau (en plaque équatoriale) dans la pipette d'aspiration

Plusieurs types de cellule donneuse de noyau: cellules embryonnaires ou somatiques.
 

Embryon au stade morula sur lequel seront prélevées les cellules donneuses de noyau.	Celllules embryonnaires prêtes au transfert de noyau.	Cellules somatiques en culture, ici fibroblastes de muscles ou de peau.	Cellules somatiques prêtes au trasfert de noyau

Fusion de la cellule donneuse avec l'ovocyte: le "transfert de noyau"
 

Mise en place d'une cellule embryonnaire sous la zone pellucide	Ou mise en place d'une cellule somatique sous la zone pellucide	Dans les deux cas la pénétration du noyau de la cellule donneuse dans le cytoplasme de l'ovocyte est assuré par fusion des membranes des deux cellules

Développement de l'embryon
 

Blastocyste de bovin, la masse interne contient les cellules qui donneront le futur embryon

Dispositifs techniques
 

Dispositif général utilisé pour le transfert de noyau sous contrôle microscopique, avec prise de vues. Photo F. Jauzein INRP	Patrick Chesné (INRA-Jouy en Josas) au travail de micromanipulation sous microscope.  Photo F. Jauzein INRP	Cuve de micromanipulation: à gauche pipette de contention de l'ovocyte, à droite pipette plus fine, pour l'introduction de la cellule étrangère (ou l'injection d'ADN lors d'une transgénèse). Photo F. Jauzein INRP	Fusion de la cellule étrangère avec l'ovocyte (l'embryon est placé dans la goutte centrale). Le courant de fusionnage est de 1kV/cm pendant quelques dizaines de ms. Il entraîne la formation de micropores dans les membranes, facilitant leur fusion. Photo F. Jauzein INRP

II - Deux stratégies possibles

Il existe deux techniques selon que l'activation de l'ovocyte (bloqué en Métaphase II) a lieu en même temps que la fusion avec la cellule étrangère ou avant cette fusion.

Dans le premier type de protocole, "MII Ovocyte", il y fusion avec la cellule étrangère et activation simultanée de l'ovocyte énucléé. C'est le courant électrique utilisé pour cette fusion qui crée un début d'activation transitoire, complétée par l'utilisation de substance chimique bloquant l'activité MPF (cycloheximide).

Une activité MPF élevée entraine la division du noyau, la rupture de l'enveloppe nucléaire, la condensation des chromosomes....L'activation de l'ovocyte n'est possible qu'en présence d'une activité MPF basse.
Le MPF ou Mitotic Promoting Factor est un complexe protéique constitué de la protéine du gène CDC2 (régulateur du cycle cellulaire) et de cycline B. En inhibant la synthèse protéique (cycloheximide) on inhibe la roduction de cycline B et donc la formation du MPF, ce qui permet l'activation de l'ovocyte, c'est à dire la reprise de sa meiose, l'expulsion de son deuxième globule polaire et son passage en phase G1.
Dans le noyau qui a été transféré dans le cytoplasme de l'ovocyte en métaphse II, où une activité MPF existe encore, on observe une disparition de l'enveloppe nucléaire et une condensation prématurée de la chromatine (PCC), avec expulsion d'un globule polaire (comme si le noyau "obeissait" aux ordres du cytoplasme), puis une décondensation du noyau, suivie de son gonflement, et sa réplication avant la première division de segmentation.

Dans le deuxième type de protocole, "aged cooled oocyte", l'activation de l'ovocyte énucléé (par les substances chimiques bloquant l'activité MPF) a lieu avant sa fusion avec la cellule donneuse de noyau. La fusion a donc lieu plus tardivement par fusion electrique, lorsque l'activité MPF est basse et après 6h de refroidissement, alors que l'ovocyte est passé en interphase (phase G1). 
 

Deux types de méthode existent pour la reconstitution d'embryons par transfert nucléaire, selon que le noyau est transféré dans un ovocyte en métaphase II (l'activation a lieu en même temps que la fusion) ou dans un ovocyte en interphase (activé préalablement à la fusion).

Réaction du noyau transféré et influence sur le nombre de chromosome de la cellule créée.
 

Si l'on pratique la première méthode, "MII oocyte", le noyau transféré subit une division, il faut donc tenir compte de son nombre de chromatides pour éventuellement empêcher cette scission (par la cytochalasine). Dans la deuxième méthode, "aged cooled oocyte", le noyau ne subit aucune division , la cellule donneuse peut être prise à n'importe quelle phase de l'interphase.

Dans la première méthode , si le nombre de chromosomes présents dans le noyau donneur est [2n,1c] (chromosomes non dupliqués) et non [2n,2c], au moment où la fin de la méiose a lieu, l'expulsion du "deuxième" globule polaire entraînerait la perte de la moitié des chromatides, on utilise dans ce cas de la cytochalasine pour empêcher l'expulsion de ce globule polaire.

Dans la deuxième méthode le noyau transféré est maintenu intact tel qu'il était dans la cellule donneuse, il ne subit pas de caryocinèse. Le cycle de réplication du noyau transféré se cale simplement sur le cycle de l'ovocyte; la réplication se fait si besoin, selon le stade auquel se trouvait le noyau transféré (G1 , S ou G2).

Le premier type de protocole est utilisé pour le transfert de cellules somatiques, qui sont synchronisables en G0 et G1 (car cultivées suffisamment longtemps). Ce protocole favorise la reprogrammation du noyau étranger, mais on ne sait pas encore comment.

Le deuxième type de protocole est bien adapté pour le transfert de cellules embryonnaires (cellules en cycle rapide, souvent en phase S).