Le marquage des sondes

On distingue :

les sondes radioactives(dites "chaudes)

- double brins

- simple brin

des sondes non radioactives(dites" froides").

Les sondes radioactives

Les sondes double brins

Phosphore 32 est le radioisotope le + utilisé. Incorporé dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou + nucléotides triP radiomarqués

Existe des sondes mono ou double brins

Soufre 35, H 3 utilisés plutôt pour le séquençage et hybridation in situ.

marquage en 5' : avec la T4 polynucléotide kinase.Marquage pour les oligonucléotides de synthèse.

Marquage par amorçage au hasard (Random Printing) :

très employé dans les laboratoires pour par ex. les Southern et Northern Blot. permet d'obtenir des activités spécifiques plus élevées, nécessaires pour détecter un gène sur qq. mG d'ADN génomique. consiste à :
* séparer les 2 brins de la sonde par chauffage
* ajouter un cocktail d'hexanucléotides synthétiques + ADN pol. + dNTP(dont un radioactif)

Marquage en 3' :

*avec une ADN pol. : fragment de Klenow, T4 ADN pol., Taq pol., transscriptase reverse) *remplissage d'un site 5' sortant généré par une enzyme de restriction. Schéma
*avec une exonucléase
*avec une terminal transférase

Marquage par translation de coupure(Nick Translation) :

utilise 2 enzymes :

*DNAseI dans des conditions ménagées pour générer quelques coupures simple brin dans le fragment d'intérêt

*DNA pol.I pour dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymériser en présence d'un nucléotide chaud.

Les sondes simple brin

- d'ADN : Schéma
*sondes à activité spécifique importante(Southern, Northern Blot)

*protection contre la nucléase S1, hybridation in situ.Avantage : ne se renature pas sur elle-même lors de l'hybridation.

- d'ARN : ribosondes. Schéma
*rendements d'hybridation meilleurs par rapport aux hybrides ADN-ADN, plus stables
*pour hybridation in situ

*cartographie des ARN

Attention : les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients :

nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, un maniement des sondes inconfortable
décroissance rapide du P32, d'ou ubesoin de marquer les sondes fréquemment.

Pour pallier à ces problèmes, on peut avoir recours aux sondes froides.

Les sondes froides

Attention : ces sondes présentent un problème de sensibilité et leur utilisation ne fait pas toujours l'unanimité.

- à réaction colorée :
*marquage par la digoxigénine. Schéma

*marquage par la biotine-streptavidine. Schéma

- sondes sulfonnées : Schéma