Transgenèse animale

Transgenèse animale

Les techniques de transfert de gènes chez les animaux

Rédigé par : Vincent Thizeau

Relu par : Louis-Marie Houdebine, Unité Biologie du Développement et Biotechnologie. INRA, 78352 Jouy-en-Josas Cedex.

La transgenèse animale a été réalisée avec succès pour la première fois il y a 18 ans, lorsqu'en 1982 R.D. Palmiter, R.L. Brinster et leurs collègues obtenaient des souris transgéniques exprimant très intensément le gène d'hormone de croissance de rat, jusqu'au point de devenir géantes : un transgène pouvait très bien fonctionner chez son hôte et modifier très significativement sa physiologie. Depuis ce premier résultat, les chercheurs se sont aperçus qu'il n'existe pas une ou des méthodes universelles pour le transfert de gène chez les animaux mais différentes techniques qui doivent être considérées espèce par espèce.

A l'inverse des plantes, les animaux ne peuvent être régénérés à partir seulement d'une cellule somatique. L'embryon est donc un passage obligé à un moment ou à un autre si l'expérimentateur souhaite obtenir une lignée d'animaux transgéniques.

Aussi, dans ce qui suit, les deux premières parties font le point sur la micro-injection de gènes dans les embryons (bien maîtrisée actuellement chez plusieurs espèces) puis sur le transfert de gènes par l'intermédiaire de cellules embryonnaires (essentiellement maîtrisé à partir de cellules embryonnaires de souris). Pour finir, une troisième partie aborde des techniques encore mal maîtrisées mais constituant des perspectives dans l'avenir : le transfert des gènes dans les gamètes.

1 - La micro-injection de gène chez les animaux :

La micro-injection du gène en solution directement dans le noyau des cellules en culture est la meilleure méthode de transfert de gène, mais aussi la plus délicate à mettre en œuvre. C'est celle qui a été retenue pour obtenir des animaux transgéniques.

Chez la souris et d'autres mammifères (lapin, porc, mouton, chèvre, vache), il est possible d'injecter directement une solution contenant de l'ADN dans un œuf fécondé, à l'aide d'une micropipette, sous contrôle microscopique. L'injection a lieu dans l'un des deux noyaux (pronuclei) fournis par les cellules sexuelles mâle et femelle, juste avant qu'ils ne fusionnent. L'embryon est ensuite transplanté dans l'oviducte ou l'utérus d'une femelle. Par cette méthode, 10 à 30 % des nouveau-nés descendants intègrent le gène étranger au sein du génome de leurs gamètes (cf. figure 1).

Figure 1 : l'exemple du transfert de gène de l'hormone de croissance humaine par micro-injection chez l'embryon de souris.

La préparation de bastocystes transgéniques in vitro pour faciliter la transgenèse :

Chez les gros animaux domestiques peu prolifiques et coûteux (jusqu'à maintenant essentiellement les ruminants) l'obtention de blastocystes totalement in vitro est possible. Les ovocytes en cours de maturation peuvent être récupérés dans les abattoirs ou directement in vivo par collecte à partir des animaux matures. La culture puis l'identification des blastocystes transgéniques permet de réduire considérablement le nombre de femelles receveuses. Ceci est nécessaire si l'on veut que ces opérations puissent se faire à un coût raisonnable (cf. figure 2).

Figure 2 : un exemple de manipulation des embryons de vache pour faciliter la transgenèse.

Remarque :

En plus de la micro-injection de gènes dans les embryons de mammifères de laboratoire et domestiques, cette technique a été réalisée avec succès chez des embryons d'oiseaux (le poulet, la caille), chez les poissons (les Salmonidés) et chez des invertébrés (des nématodes, des mollusques, des crevettes, des oursins, la drosophile). Notons que les problèmes techniques posés sont spécifiques de chaque espèce.

2 - Le transfert de gènes par l'intermédiaire de cellules embryonnaires :

Constat : les cellules des embryons précoces (blastomères) sont totipotentes. Elles peuvent participer au développement lorsqu'elles sont réintroduites dans un embryon du même stade.

Des lignées de cellules de carcinome embryonnaire (EC), de cellules embryonnaires souches (ES) et de cellules primordiales germinales (EG) peuvent avoir gardé leur totipotence et participer au développement d'un embryon receveur (cf. figure 3).

Figure 3 : les différentes lignées de cellules embryonnaires.

Intérêt pour la transgenèse : ces cellules embryonnaires peuvent être prélevées sur un embryon, être maintenues en culture, recevoir un gène étranger puis finalement être réintroduites dans un embryon précoce. Dans le meilleur des cas, l'animal chimère qui résulte de cette opération est mosaïque pour le transgène (autrement dit ce dernier n'est présent que dans un partie des cellules) - cf. figure 4.

Figure 4 : l'exemple du transfert du gène CFTR humain par l'intermédiaire de cellules embryonnaires de souris.

3 - Perspectives : le transfert de gènes dans les gamètes (des techniques encore mal maîtrisées)

Dans les ovocytes, le transfert direct par micro-injection d'ADN dans le cytoplasme ou la vésicule germinale des ovocytes a été tenté chez plusieurs espèces, notamment chez les gros animaux domestiques. Ces essais se sont soldés par des échecs.

Des spermatozoïdes, peuvent être isolés, incubés en présence d'ADN puis être utilisés pour réaliser une fécondation in vivo ou in vitro. Il peut même être introduit dans un ovocyte par micro-injection si sa motilité ou son intégralité ont été endommagées par l'incubation. Ainsi, des expériences ont été réalisées chez l'oursin, la souris, le rat, le lapin, le mouton, le porc, la vache, la truite, la carpe, le poisson zèbre et le poulet. La technique d'éléctroporation a même été utilisée pour transférer de l'ADN étranger dans les spermatozoïdes de coquillages.

Les résultats expérimentaux montrent qu'une fois transféré, le gène intégré dans l'organisme n'était plus intègre, réarrangé et non fonctionnel (cas de travaux chez la vache et le poulet) ou qu'il n'y avait pas établissement de lignées stables d'organismes transgéniques (cas de travaux chez la carpe, le poisson chat, le saumon, la loche).

Dans tous les cas les résultats expérimentaux montrent que le spermatozoïde mature n'est pas un véhicule bien maîtrisé pour le transfert de gène. Son ADN est très fortement condensé et ne se réplique pas. L'ADN étranger ne peut vraisemblablement pas s'intégrer. Il ne peut donc probablement au mieux que porter le gène jusqu'à l'intérieur de l'ovocyte pour s'intégrer éventuellement ensuite à la faveur de la réplication de l'ADN de l'embryon. Le spermatozoïde est par ailleurs peut-être doté d'un mécanisme de protection qui détruit toute séquence d'ADN étranger. D'où l'idée d'utiliser les précurseurs des spermatozoïdes comme véhicule pour transférer des gènes étrangers.

Figure 5 : utilisation potentielle des spermatogonies cultivées et maturées in vitro en spermatides pour transférer des gènes étrangers dans des organismes entiers (exemple de travaux réalisés chez la souris).

Des travaux récents ont montré que des spermatogonies de souris maintenues quelques heures en culture pouvaient achever leur maturation après réimplantation dans le testicule d'une autre souris préalablement débarrassé de ses propres spermatogonies par un traitement pharmacologique approprié. Les souriceaux issus des mâles ayant subi une transplantation des spermatogonies dérivaient en majorité de l'animal donneur de spermatogonies. Il est concevable que les spermatogonies soient cultivées sans se différencier pendant un laps de temps suffisant pour permettre un transfère de gène par transfection classique ou via une recombinaison homologue (cf. figure 6).

Plus récemment, on a montré que des spermatogonies de rat pouvaient achever leur maturation dans le testicule de souris adoptives. Selon les auteurs de cette recherche, le rat et la souris différent suffisamment pour que l'on puisse raisonnablement envisager la maturation des spermatogonies de gros mammifères dans le testicule de souris adoptive. Notons toutefois que cette technique est encore mal maîtrisée.

Figure 6 : utilisation de spermatogonies réintroduites et maturées dans le testicule de souris adoptive pour transférer des gènes étrangers dans des organismes entiers.

Une autre approche plus simple et peut-être exploitable consiste à faire la transfection des cellules souches précurseurs des spermatozoïdes directement in situ dans le testicule (travaux en cours chez la souris et le porc).

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Mise à jour : 14/08/2001 Glossaire Histoire Téléchargements Les étapes de la transgenèse Transgenèse végétale Transgenèse animale	Transgenèse animale Les techniques de transfert de gènes chez les animaux Rédigé par : Vincent Thizeau Relu par : Louis-Marie Houdebine, Unité Biologie du Développement et Biotechnologie. INRA, 78352 Jouy-en-Josas Cedex. La transgenèse animale a été réalisée avec succès pour la première fois il y a 18 ans, lorsqu'en 1982 R.D. Palmiter, R.L. Brinster et leurs collègues obtenaient des souris transgéniques exprimant très intensément le gène d'hormone de croissance de rat, jusqu'au point de devenir géantes : un transgène pouvait très bien fonctionner chez son hôte et modifier très significativement sa physiologie. Depuis ce premier résultat, les chercheurs se sont aperçus qu'il n'existe pas une ou des méthodes universelles pour le transfert de gène chez les animaux mais différentes techniques qui doivent être considérées espèce par espèce. A l'inverse des plantes, les animaux ne peuvent être régénérés à partir seulement d'une cellule somatique. L'embryon est donc un passage obligé à un moment ou à un autre si l'expérimentateur souhaite obtenir une lignée d'animaux transgéniques. Aussi, dans ce qui suit, les deux premières parties font le point sur la micro-injection de gènes dans les embryons (bien maîtrisée actuellement chez plusieurs espèces) puis sur le transfert de gènes par l'intermédiaire de cellules embryonnaires (essentiellement maîtrisé à partir de cellules embryonnaires de souris). Pour finir, une troisième partie aborde des techniques encore mal maîtrisées mais constituant des perspectives dans l'avenir : le transfert des gènes dans les gamètes. 1 - La micro-injection de gène chez les animaux : La micro-injection du gène en solution directement dans le noyau des cellules en culture est la meilleure méthode de transfert de gène, mais aussi la plus délicate à mettre en œuvre. C'est celle qui a été retenue pour obtenir des animaux transgéniques. Chez la souris et d'autres mammifères (lapin, porc, mouton, chèvre, vache), il est possible d'injecter directement une solution contenant de l'ADN dans un œuf fécondé, à l'aide d'une micropipette, sous contrôle microscopique. L'injection a lieu dans l'un des deux noyaux (pronuclei) fournis par les cellules sexuelles mâle et femelle, juste avant qu'ils ne fusionnent. L'embryon est ensuite transplanté dans l'oviducte ou l'utérus d'une femelle. Par cette méthode, 10 à 30 % des nouveau-nés descendants intègrent le gène étranger au sein du génome de leurs gamètes (cf. figure 1). Figure 1 : l'exemple du transfert de gène de l'hormone de croissance humaine par micro-injection chez l'embryon de souris. La préparation de bastocystes transgéniques in vitro pour faciliter la transgenèse : Chez les gros animaux domestiques peu prolifiques et coûteux (jusqu'à maintenant essentiellement les ruminants) l'obtention de blastocystes totalement in vitro est possible. Les ovocytes en cours de maturation peuvent être récupérés dans les abattoirs ou directement in vivo par collecte à partir des animaux matures. La culture puis l'identification des blastocystes transgéniques permet de réduire considérablement le nombre de femelles receveuses. Ceci est nécessaire si l'on veut que ces opérations puissent se faire à un coût raisonnable (cf. figure 2). Figure 2 : un exemple de manipulation des embryons de vache pour faciliter la transgenèse. Remarque : En plus de la micro-injection de gènes dans les embryons de mammifères de laboratoire et domestiques, cette technique a été réalisée avec succès chez des embryons d'oiseaux (le poulet, la caille), chez les poissons (les Salmonidés) et chez des invertébrés (des nématodes, des mollusques, des crevettes, des oursins, la drosophile). Notons que les problèmes techniques posés sont spécifiques de chaque espèce. 2 - Le transfert de gènes par l'intermédiaire de cellules embryonnaires : Constat : les cellules des embryons précoces (blastomères) sont totipotentes. Elles peuvent participer au développement lorsqu'elles sont réintroduites dans un embryon du même stade. Des lignées de cellules de carcinome embryonnaire (EC), de cellules embryonnaires souches (ES) et de cellules primordiales germinales (EG) peuvent avoir gardé leur totipotence et participer au développement d'un embryon receveur (cf. figure 3). Figure 3 : les différentes lignées de cellules embryonnaires. Intérêt pour la transgenèse : ces cellules embryonnaires peuvent être prélevées sur un embryon, être maintenues en culture, recevoir un gène étranger puis finalement être réintroduites dans un embryon précoce. Dans le meilleur des cas, l'animal chimère qui résulte de cette opération est mosaïque pour le transgène (autrement dit ce dernier n'est présent que dans un partie des cellules) - cf. figure 4. Figure 4 : l'exemple du transfert du gène CFTR humain par l'intermédiaire de cellules embryonnaires de souris. 3 - Perspectives : le transfert de gènes dans les gamètes (des techniques encore mal maîtrisées) Dans les ovocytes, le transfert direct par micro-injection d'ADN dans le cytoplasme ou la vésicule germinale des ovocytes a été tenté chez plusieurs espèces, notamment chez les gros animaux domestiques. Ces essais se sont soldés par des échecs. Des spermatozoïdes, peuvent être isolés, incubés en présence d'ADN puis être utilisés pour réaliser une fécondation in vivo ou in vitro. Il peut même être introduit dans un ovocyte par micro-injection si sa motilité ou son intégralité ont été endommagées par l'incubation. Ainsi, des expériences ont été réalisées chez l'oursin, la souris, le rat, le lapin, le mouton, le porc, la vache, la truite, la carpe, le poisson zèbre et le poulet. La technique d'éléctroporation a même été utilisée pour transférer de l'ADN étranger dans les spermatozoïdes de coquillages. Les résultats expérimentaux montrent qu'une fois transféré, le gène intégré dans l'organisme n'était plus intègre, réarrangé et non fonctionnel (cas de travaux chez la vache et le poulet) ou qu'il n'y avait pas établissement de lignées stables d'organismes transgéniques (cas de travaux chez la carpe, le poisson chat, le saumon, la loche). Dans tous les cas les résultats expérimentaux montrent que le spermatozoïde mature n'est pas un véhicule bien maîtrisé pour le transfert de gène. Son ADN est très fortement condensé et ne se réplique pas. L'ADN étranger ne peut vraisemblablement pas s'intégrer. Il ne peut donc probablement au mieux que porter le gène jusqu'à l'intérieur de l'ovocyte pour s'intégrer éventuellement ensuite à la faveur de la réplication de l'ADN de l'embryon. Le spermatozoïde est par ailleurs peut-être doté d'un mécanisme de protection qui détruit toute séquence d'ADN étranger. D'où l'idée d'utiliser les précurseurs des spermatozoïdes comme véhicule pour transférer des gènes étrangers. Figure 5 : utilisation potentielle des spermatogonies cultivées et maturées in vitro en spermatides pour transférer des gènes étrangers dans des organismes entiers (exemple de travaux réalisés chez la souris). Des travaux récents ont montré que des spermatogonies de souris maintenues quelques heures en culture pouvaient achever leur maturation après réimplantation dans le testicule d'une autre souris préalablement débarrassé de ses propres spermatogonies par un traitement pharmacologique approprié. Les souriceaux issus des mâles ayant subi une transplantation des spermatogonies dérivaient en majorité de l'animal donneur de spermatogonies. Il est concevable que les spermatogonies soient cultivées sans se différencier pendant un laps de temps suffisant pour permettre un transfère de gène par transfection classique ou via une recombinaison homologue (cf. figure 6). Plus récemment, on a montré que des spermatogonies de rat pouvaient achever leur maturation dans le testicule de souris adoptives. Selon les auteurs de cette recherche, le rat et la souris différent suffisamment pour que l'on puisse raisonnablement envisager la maturation des spermatogonies de gros mammifères dans le testicule de souris adoptive. Notons toutefois que cette technique est encore mal maîtrisée. Figure 6 : utilisation de spermatogonies réintroduites et maturées dans le testicule de souris adoptive pour transférer des gènes étrangers dans des organismes entiers. Une autre approche plus simple et peut-être exploitable consiste à faire la transfection des cellules souches précurseurs des spermatozoïdes directement in situ dans le testicule (travaux en cours chez la souris et le porc).