Les précautions sanitaires

La manipulation d'un sol en classe ne comporte pas plus de danger qu'une activité de jardinage ou de nettoyage de chaussures après une promenade en forêt.

Les risques potentiels de cette manipulation se posent une fois la culture réalisée. Certains germes pathogènes, naturellement peu présents dans le sol, peuvent être sélectionnés et multipliés lors de cette culture. Afin d'éviter toute contamination, il est indispensable:

• de fermer hermétiquement les boîtes de Pétri (avec un film de type "parafilm" préservant les échanges gazeux) dès la mise en culture
• de ne jamais ouvrir une boîte ensemencée,
• de détruire à l'autoclave les boîtes après observation.

Texte réglementaire (à partir du BO n°43 du 22/10/1973)

Les précautions scientifiques

Ces remarques scientifiques sont issues d'un entretien avec Madame Claire Chenu (Maître de Conférences à l’Institut National Agronomique Paris-Grignon) Grignon le 23 Janvier 2007.

Le protocole suivant permettra de comparer la diversité des micro-organismes cultivables de différents sols. Claire chenu insiste sur le fait que cette diversité  n'est pas représentative de la diversité globale en micro-organismes dans un sol. Non seulement parce que de nombreux micro-organismes extraits ne pourront pas se développer en culture, mais surtout parce qu'une majorité de micro-organsimes reste fortement liée aux particules du sol et ne peut être extraite.

Claire Chenu explique que la microbiodiversité globale n'a été que récemment révélée par des analyses de génomique : 10.000 à 15.000 génomes bactériens sont présents par gramme de sol lequel représente de fait un immense réservoir de diversité.

Claire Chenu précise que la microbiodiversité du sol n'est pas représentative de la biodiversité totale de l'écosystème auquel ce sol participe. En effet, on observe dans le sol une forte redondance fonctionnelle (beaucoup de micro-organismes exerçant la même fonction écologique mais dans des conditions édaphiques différentes)

Le protocole

Objectif : Sensibiliser les élèves aux études sur la biodiversité par l’étude de la diversité des microorganismes cultivables présents dans différents échantillons de sols.

On expose ici le protocole de mise en culture. Une étude préalable du contenu en eau du sol permettrait une démarche plus rigoureuse à partir dune même masse de matière sèche et non d’un même volume, pour différents échantillons.

Matériel nécessaire : 

 Echantillon de sol et dosette  et eau ou liquide physiologique pour la mise en suspension

Matériel de culture  : billes en verre pour étaler le prélèvement, milieux de culture (complet- type Sabouraud, complet avec antibactérien, complet avec antifongique, minimum pour détecter les autotrophes à la lumière cf. annexe)

Poste de culture en milieu stérile 

Mode opératoire :

• Homogénéiser l’échantillon en cassant les agrégats à la main . Prélever un volume précis (ex. dosette de lait maternisé, soit 10 mL) de terre

On travaille alors dans des conditions de stérilité, ou, comme ici, en effectuant un témoin avec le seul liquide de mise en suspension, laissé à l’air libre

• Verser  la terre dans un flacon de 50 mL à vis  puis ajouter 20 mL  d’eau ou de liquide physiologique (pour éviter les chocs osmotiques)
• Homogénéiser doucement pendant 2 min en agitant par rotation  puis laisser décanter 10 min

Impérativement en condition stérile , effectuer la mise en culture

• Distribuer dans chaque boite une dizaine de billes en verre
• Prélever en surface le surnageant dans la partie claire, à l’aide d’une pipette stérile et déposer soit une goutte (dénombrement des cellules) soit 3 gouttes (tests d’activité biologique) sur le milieu de culture approprié (cf. annexe) (dépôt témoin , dépôt de l’échantillon )
• Agiter les boites par un mouvement horizontal circulaire, afin que les billes répartissent le prélèvement sur la gélose
• Retourner  les boites , éliminer les billes en les déposant dans un bécher, en condition stérile (ces billes sont réutilisables, cf. annexe).
• Fermer hermétiquement les boîtes à l'aide d'un ruban de type "Parafilm".
• Mettre  à incuber au moins 48h à une température constante comprise entre 20° et 30°C (boites retournées sur leurs couvercles).

Paramètres pouvant être mesurés

• Nombre de colonies se développant sur les différents milieux (opérer sur des colonies isolées, en notant bien la taille, morphologie, couleur, homogénéité etc. de chaque colonie)
• Activité bactéricide : test sur boites avec colonies de bactéries (ex E.coli ou B. subtilis)  confluentes, en mesurant les diamètres des plages de lyse
• Activité fongicide : même principe, sur des levures (S. cerevisiae, par ex)
• Activité amylase : test sur boite gélose plus amidon, diamètre du halo après coloration au Lugol
• Activité lipase : test sur boite gélosée avec émulsion d’huile (a mettre au point)
• Activité protéase : test sur boites peptone-caséine, diamètre halo après coloration de biuret
• Activité mutagène (cf. annexe)

Voir le protocole en images