L'hybridation moléculaire

L' hybridation moléculaire sur support solide

Objectif : détecter la présence d'un acide nucléique d'une séquence donnée par utilisation d'une sonde.
Sonde : fragment d'ADN ou ARN marqué ; générée in vitro avec une séquence complémentaire de la séquence recherchée.

Rappel sur l'hybridation
*Principe* Quand un ensemble d'acides nucléiques double brins de séquences différentes est dénaturé(séparation des brins) par la chaleur ou par un choc alcalin + puis placé dans des conditions favorables, il y a *réassociation spécifique = hybridation* des ADN simple brin pour former les homoduplex originels. Schéma	*Utilisation :* considérons... un ensemble ADN+ARN dénaturé puis fixé sur support ayant de l'affinité pour les acides nucléiques(nitrocell. ou nylon) fixés, les brins ne peuvent se renaturer mais peuvent s'hybrider s'il y a complémentarité avec une sonde marquée après lavage pour élimiber la onde non hybridée sur sa cible, la séquence recherchée est détectée. Schéma
Conditions d'hybridation et de lavages
*La température de fusion (Tm)* Un fragment d'ADN de séquence donnée a une Tm qui correspond à la température où 50%des fragments sont sous forme simple brin. Tm dépend (formule mathématique à l'appui)de la longueur du fragment d'ADN, de sa composition en bases, de la présence de certains ions dans le milieu. Schéma	*Réalisation de l'hybridation et lavages* Choisir pour chaque sonde une Température d'hybridation et de lavage inférieure à Tm. (environs 5à10°C en moins). Ceci pour favoriser et conserver l'association de la sonde sur sa cible et défavoriser les misappariements de la sonde avec une séquence homologue.
Applications
Southern Northern Dot Western Blot hybridation in situ	Détecter des mutations ponctuelles Sachant que Tm pour un duplex court (inf. 50bases) est inférieure de 1°C pour chaque % de misappariements, utiliser des oligonucléotides de synthèse courts(20bases).