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Mise
à jour : 14/08/2001
Glossaire Histoire Téléchargements Précautions Préparation de bactéries Transformation bactérienne Préparation d'ADN plasmidique Digestion de l'ADN Transfert d'ADN sur membrane Hybridation Révélation de l'hybridation Marquage de l'ADN et purification |
Préambule : vous pouvez éviter de mettre en oeuvre ce protocole en commandant directement à un laboratoire des bactéries compétentes. Toutefois, il est toujours judicieux de connaître l'un des procédés permettant de perméabiliser la paroi bactérienne ( = bactéries compétentes). Protocole - pour 50 mL de culture 1 - Ensemencer le milieu liquide Luria Broth (LB) au 1/100 avec culture de la nuit. Incuber à 37°C avec agitation. 2 - Quand DO550 = 0,45 bloquer la croissance dans la glace pendant 15 minutes. Transférer dans des récipients de centrifugation refroidis. 3 - Centrifuger 15 minutes à 2500 rotations par minute (rpm) à 4°C. 4 - Jeter le surnageant en égouttant au maximum et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl2 100mM glacé avec agitation douce. Compléter à 20 mL avec la même solution. 5 - Conserver 15 minutes dans la glace (ou plus). 6 - Centrifuger 15 minutes à 2500 rpm à 4°C. 7 - Jeter le surnageant, essuyer les parois et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl2 100mM -15% glycérol glacé avec agitation douce. Compléter à 1,25 mL. 8 - Laisser dans la glace 15 minutes au moins. 9 - Aliquoter, refroidir dans l'azote liquide. Conserver à -70°C. |