Transformation bactérienne

Transformation bactérienne

Préalable : Préparer des tubes de bactéries compétentes contenant 100µL d'une suspension de cellules d'Escherichia coli. Ils doivent être maintenus dans de la glace.

Les manipulations devront se faire stérilement près d'un bec Bunsen allumé.

Protocole :

1 - t = 0. Ajouter l'ADN dans les tubes ; agiter le tube. Les bactéries restent dans la glace.

2 - t = 25 minutes. Agiter légèrement et transférer les tubes dans un bain-marie à 37°C pendant 3 minutes.

3 - t = 28 minutes. Agiter legèrement et laisser les tubes 10 minutes à températures dans la pièce.

4 - t = 38 minutes. Ajouter stérilement 0,5 mL de milieu liquide Luria Broth (LB) préchauffé à 37°C ; agiter légèrement. Transférer à 37°C durant 60 minutes.

5 - t = 98 minutes. Agiter légèrement et étaler les bactéries (éventuellement après dilution selon le protocole qui aura été discuté). Sur chaque boîte, étaler 100µL de la suspension de bactéries.

Remarque : pendant les temps morts les boîtes des différents milieux seront marquées et les tubes de dilution préparés, selon le protocole que vous aurez entrepris.

Commentaires :

1^ère étape : l'ADN en solution dans le tube va venir s'adsorber à la surface des bactéries. Il n'entre pas dans les bactéries car à 0°C les phospholipides sont figés (donc les menbranes sont figées).

2^ème étape : on passe de 0°C à 37°C. La fluidité membranaire se trouve alors presque instantanément restaurée. Ceci permet à l'ADN de franchir les enveloppes bactériennes.

3^ème étape : retour à température ambiante.

4^ème et 5^ème étapes : le milieu liquide LB préchauffé à 37°C va restaurer le métabolisme et la croissance des bactéries (1 à 2 cycles de division). Durant 60 minutes le plasmide (ADN, par exemple pBR329) va pouvoir se répliquer ; il y aura expression des protéines et resistance aux antibiotiques. Puis on triera les bactéries sensibles et les bactéries resistantes en les plaçant sur un milieu renfermant un antibiotique (principe de sélection positive par expression directe). On récupérera ainsi les bactéries transformées.

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Mise à jour : 14/08/2001 Glossaire Histoire Téléchargements Précautions Préparation de bactéries Transformation bactérienne Préparation d'ADN plasmidique Digestion de l'ADN Transfert d'ADN sur membrane Hybridation Révélation de l'hybridation Marquage de l'ADN et purification	Transformation bactérienne Préalable : Préparer des tubes de bactéries compétentes contenant 100µL d'une suspension de cellules d'Escherichia coli. Ils doivent être maintenus dans de la glace. Les manipulations devront se faire stérilement près d'un bec Bunsen allumé. Protocole : 1 - t = 0. Ajouter l'ADN dans les tubes ; agiter le tube. Les bactéries restent dans la glace. 2 - t = 25 minutes. Agiter légèrement et transférer les tubes dans un bain-marie à 37°C pendant 3 minutes. 3 - t = 28 minutes. Agiter legèrement et laisser les tubes 10 minutes à températures dans la pièce. 4 - t = 38 minutes. Ajouter stérilement 0,5 mL de milieu liquide Luria Broth (LB) préchauffé à 37°C ; agiter légèrement. Transférer à 37°C durant 60 minutes. 5 - t = 98 minutes. Agiter légèrement et étaler les bactéries (éventuellement après dilution selon le protocole qui aura été discuté). Sur chaque boîte, étaler 100µL de la suspension de bactéries. Remarque : pendant les temps morts les boîtes des différents milieux seront marquées et les tubes de dilution préparés, selon le protocole que vous aurez entrepris. Commentaires : 1^ère étape : l'ADN en solution dans le tube va venir s'adsorber à la surface des bactéries. Il n'entre pas dans les bactéries car à 0°C les phospholipides sont figés (donc les menbranes sont figées). 2^ème étape : on passe de 0°C à 37°C. La fluidité membranaire se trouve alors presque instantanément restaurée. Ceci permet à l'ADN de franchir les enveloppes bactériennes. 3^ème étape : retour à température ambiante. 4^ème et 5^ème étapes : le milieu liquide LB préchauffé à 37°C va restaurer le métabolisme et la croissance des bactéries (1 à 2 cycles de division). Durant 60 minutes le plasmide (ADN, par exemple pBR329) va pouvoir se répliquer ; il y aura expression des protéines et resistance aux antibiotiques. Puis on triera les bactéries sensibles et les bactéries resistantes en les plaçant sur un milieu renfermant un antibiotique (principe de sélection positive par expression directe). On récupérera ainsi les bactéries transformées.