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La cytométrie en flux

La cytométrie en flux (Flow cytometry) est une technique qui permet d'étudier rapidement quelques caractéristiques d'un grand nombre de cellules (plusieurs dizaines de milliers). Il est donc possible d'en tirer des statistiques fiables.

Un logiciel gratuit  : Cytométrie est disponible pour traiter les données fournies par les cytomètres.

I - Le principe du fonctionnement

Les cellules que l'on veut étudier doivent être mises en suspension dans un milieu. Si nécessaire, on peut utiliser un milieu permettant la survie des cellules.
Les cellules sont poussées par un système de pompe et envoyées une à une devant un (ou plusieurs) faisceau laser qui permet de mesurer ou d'évaluer des paramètres cellulaires (voir aussi quelques précisions).

circulation_fluides.PNG
Ainsi, la lumière diffractée mesurée en face du rayon laser permet d'évaluer la taille des cellules (paramètre FSC).

FSC.jpg

La lumière diffractée, mesurée sur le côté (paramètre SSC) donne une mesure de la granularité de la cellule.

SSC.jpgLa position précise du détecteur dépend du modèle de cytomètre.

Cette granularité correspond à la complexité de la cellule (densité des organites, des irrégularités internes ou de surface). Qui a déjà allumé ses phares dans le brouillard (petites gouttelettes d'eau en suspension dans l'air) comprend très vite que plus la densité des particules est grande (brouillard "épais") plus la lumière diffusée dans toutes les directions est importante.

Les paramètres FSC et SSC sont grossièrement proportionnels à la taille et à la complexité des cellules. Cela permet un premier tri des catégories cellulaires, mais ne suffit pas pour une reconnaissance précise.

Les intensités lumineuses mesurées sont très faibles, les détecteurs utilisés sont des photomultiplicateurs.

BryteHS.jpg Les appareils sont reliés à un ordinateur qui enregistre les données et affichent les résultats des mesures.

 

L'utilisation de fluorochromes ("colorants" fluorescents) permet de détecter, de manière spécifique, la présence des molécules comme les marqueurs CD des leucocytes. On peut alors parler de cytofluorométrie en flux.

II - L'utilisation de fluorochromes

 

LT_fluo.PNG

 Les lymphocytes T portent à leur surface des marqueurs spécifiques : les CD3.

Pour les mettre en évidence, on utilise des anticorps anti-CD3 associés à une molécule fluorescente (fluorochrome)

Lorsqu'un lymphocyte T passe dans le flux devant le rayon laser, la fluorescence est activée et détectée par des capteurs spécifiques.

La longueur d'onde de fluorescence est toujours plus grande que celle de la lumière excitatrice

marqueur_lympho.png  Dans le premier schéma, la taille du marqueur CD3 et celle de l'anticorps sont très exagérés par rapport à la taille de la cellule. En fait les marqueurs comme les anticorps sont très petits et ne peuvent être reconnus au microscope que par la lumière de fluorescence.
marquage_fluo.png  Cette lumière de fluorescence visible au microscope peut aussi être détectée dans le cytomètre.

 

III - Le tri des cellules

Certains appareils permettent de séparer les cellules suivant leurs caractéristiques : ce sont des FACS (Fluorescence-activated cell sorting).tri.png

Un exemple de modèle de FACS

appareil.jpg