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Dans le contexte d'une infection par le virus de la grippe Influenza, cette activité propose une exploitation de modèles moléculaires (à l'aide de Rastop) et de séquences (à l'aide de GénieGen) afin d'expliquer la spécificité des anticorps vis-à-vis des antigènes auxquels ils se lient.

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Cette démarche s'inscrit dans le thème 3-A-2 du programme de TS : "L'immunité adaptative, prolongement de l"immunité innée".

L'objectif est de mettre en évidence l'activation et le recrutement des cellules de l'immunité adaptative en réponse à une infection virale. La démarche illustre en particulier :

• le point de connaissances suivant : "Les cellules de l'immunité adaptative ne deviennent effectrices qu'après une première rencontre avec un antigène grâce aux phénomènes de sélection, d'amplification et de différenciation clonales."
• la capacité "Recenser, extraire et exploiter des informations, y compris expérimentales, sur les cellules intervenant dans l'immunité adaptative."

Protocole expérimental

Exploitation des résultats

Fichiers de données exploitables avec le logiciel Cytométrie.

Protocole expérimental

L'expérience consiste à infecter des souris par le virus de la grippe par voie intra-nasale, puis suivre l'apparition des lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus dans différents organes (ganglion lymphatique drainant les poumons, sang, poumons) au cours du temps après infection (j0 à j9 ou j0 à j11).

L'inoculation du virus par voie intra-nasale permet l'infection des poumons. Les cellules dendritiques (cellules présentatrices d'antigènes professionnelles) de cet organe capturent des antigènes viraux et migrent vers le ganglion drainant les poumons (nommé ganglion médiastinal), où elles présentent des peptides du virus aux lymphocytes. Les lymphocytes T CD8+ reconnaissants ces peptides vont alors se multiplier (expansion clonale) et migrer vers le lieu de l'infection, où ils élimineront les cellules infectées.

Dans cette expérience, nous avons suivi, après infection par la grippe par voie intra-nasale, l'apparition au cours du temps des lymphocytes T CD8+ spécifiques du peptide viral NP68 :

• dans le ganglion médiastinal (où les lymphocytes spécifiques se multiplient - fichier ganglion_j0_j11_r.fcs),
• dans le sang (par où ils circulent pour rejoindre l'organe infecté - fichier sang_j0_j11_r.fcs),
• et dans les poumons (où les lymphocytes spécifiques vont exercer leur fonction cytotoxique et éliminer les cellules infectées - fichier poumon_j0_j11.fcs).

Les cellules isolées de chaque prélèvement sont marquées à l'aide d'anticorps anti-CD8 et anti-TCR spécifique du peptide NP68, ces anticorps étant couplés à deux fluorochromes différents. Les suspensions de cellules marquées sont alors analysées par cytométrie en flux :

• Chaque fichier correspond aux données pour un prélèvement (ganglion, sang, poumons), et contient les données obtenues aux différents temps post-infection (jour 0 à jour 9 ou 11). Les trois fichiers sont disponibles dans le dossier compressé : donnees_grippe_reduites.zip.
• La fluorescence des anticorps anti-CD8 correspond au paramètre CD8 des fichiers.
• La fluorescence des anticorps anti-TCR spécifique du peptide NP68 correspond au paramètre NP68 des fichiers.

La démarche d'exploitation des données sera expliquée pour le fichier poumon_j0_j9_r.fcs qui a donné les résultats les plus tranchés.

Exploitation des résultats (pour les prélèvements effectués dans le poumon)

Chargement des données

Utiliser le menu Fichier/Ouvrir et choisir le fichier poumon_j0_j9_r.fcs.
Patienter jusqu'à ce que les 5 jeux de données soient chargés (Poumon jour 0, Poumon jour 2, Poumon jour 4, Poumon jour 7 et  Poumon jour 9). Le nombre de cellules analysées au départ est important (entre 110 000 et 400 000 suivant le jeu de données). Les données ont été simplifiées, pour faciliter leur exploitation par les élèves. Seuls les lymphocytes ont été conservés dans le fichier.
Le fichier complet peut être obtenu ici (donneesgrippesouriskatiamayol.zip), avec ceux des autres prélèvements. Il nécessite une étape préliminaire de délimitation des lymphocytes.
Le graphique Taille - Granularité s'affiche.

 Étape 1 : Choisir de nouveaux paramètres d'affichage (NP68 et CD8)

Repérer les lymphocytes CD8+

Étape 2 : Afficher les données du jour 9 et délimiter la catégorie des lymphocytes T CD8+ spécifiques de NP68

Ce sont les lymphocytesCD8+ dont la mise en évidence de l'affinité pour le peptide viral NP68 dépasse celle de la plupart des autres lymphocytes.

• puis
   

Etape 3 : Faire défiler les jours pour observer les modifications

Par exemple au jour 0
puis 

Étape 4 : Afficher les statistiques et repérer l'augmentation du % des lymphocytes T CD8+ qui reconnaissent l'antigène

     Voir l'extrait des statistiques.

Étape 5 : Afficher le graphique correspondant

Dans la fenêtre des statistiques, cliquer sur le menu Graphique .

Le graphique et son tableau associé apparaissent :

Il est possible d'ajouter un titre :

puis 

Le tableau ou le graphique peuvent être copiés

Le graphique peut être imprimé ou enregistré comme une image :

La taille du panneau contenant le tableau peut être ajustée.

S'il y avait plusieurs catégories, celle(s) qui est (ou sont) affichées peuvent être choisies à l'aide du menu Catégories.

Remarque : Dans les données complètes, il y a aussi le jour 11 où la délimitation de la catégorie de LT CD8+ reconnaissant le peptide NP68 est plus délicate.

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