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Purification par immuno-panning

Ecrit par Jean-Pierre Ternaux

Cette méthode de purification a été mise au point plus récemment par Herderson et al. (199 ). Son principe est  basé sur la présence du récepteur à basse affinité au NGF (p 75) sur la membrane du motoneurone embryonnaire.

 Les cellules dissociées à partir de la moelle épinière et du tronc cérébral sont incubées dans des boîtes de Pétri  dont le fond a été préalablement traité pour accrocher un anticorps spécifique dirigé contre la molécule p 75.

A la fin de la période d'incubation les motoneurones sont accrochés au fond de la boîte par l'intermédiaire d'un complexe antigène / anticorps (p 75 / anti p 75).

Les interneurones et les cellules gliales qui ne possèdent pas le récepteur p 75 à leurs membranes demeurent en suspension dans le milieu d'incubation.

Après incubation le surnageant est éliminé et les motoneurones purifiés sont remis en suspension dans une solution saline, centrifugés, puis repris dans un volume adéquat de milieu de culture.

image1Ripan.jpg
Purification des motoneurones par immuno-panning




Cette méthode de séparation des motoneurones embryonnaires combine l'immunocytochimie et  le tri magnétique. Des billes magnétiques de très faibles diamètres (1 à 10 µm) sont couplées avec un anticorps anti p75.

 La suspension des cellules dissociées issues des moelles épinières et des tronc cérébraux embryonnaires est  incubée en présence des billes magnétiques couplées à l'anticorps

 p 75. Dans ces conditions, les billes magnétiques vont spécifiquement  s'accrocher à la membrane des motoneurones embryonnaires.

 Après incubation, la suspension cellulaire est passée au travers d'une colonne de séparation placée dans un champ magnétique.

Les cellules marquées par l'anticorps p 75 sont retenues dans la colonne, alors que les cellules non marquées (interneurones et cellules gliales) sont éluées.

 Après rinçage de la colonne, la colonne est retirée du champ magnétique et les motoneurones sont expulsés de la colonne par passage d'une solution saline.

Après centrifugation le culot de motoneurones est remis en suspension dans du milieu de culture.

image3Ripan.jpg
Purification des motoneurones par tri magnétique

 

Pour obtenir des cultures viables de motoneurones purifiés à partir de fragment de moelle épinière ou de tronc cérébral embryonnaire, plusieurs paramètres doivent être optimisés :
     

  • Les cellules purifiées doivent adhérer au substrat de culture.
  • La densité cellulaire doit être ajustée de façon à garantir la survie des motoneurones cultivés. 
  • Le milieu de culture "défini" (en absence de sérum fœtal de veau) doit contenir les éléments nécessaires au développement des neurones en culture et en particulier l'ensemble des acides aminés essentiels nécessaires à la  synthèse protéique et les éléments chimiques indispensables à la production intracellulaire d'énergie (glucose). 
  • L'ensemble des procédures mis en œuvre dans la culture de neurones doit être effectué dans des conditions optimales de stérilité afin de ne pas introduire, dans la culture, des micro organismes contaminants: tels des bactéries ou des champignons.


Ceci exige que toutes les solutions contenant des molécules spécifiques additionnées au milieu de culture soient filtrées sur des filtres dont les pores n'excèdent  pas 0,22 µm et que toutes les opérations concernant la mise en culture soient effectuées dans une hotte à flux laminaire vertical qui assure la protection du matériel mis en culture.