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Mise en évidence de zones neurogénitrices dans le cerveau de rat

Valérie Coronas, CNRS UMR 6558 - IPBC, Bâtiment de Physiologie, 40 Avenue du Recteur Pineau 86022 POITIERS Cedex

 

 Raisonnement mis en oeuvre pour l'identification de zones neurogénitrices

 

 

bandeauTP_SVZ.jpg

Section de l'encéphale du rat, extraction des zones sous-ventriculaires (SVZ), mise en culture, développement de neurosphères au sein desquelles on peut identifier de futurs neurones par la présence de molécules spécifiques à leur surface

> les zones sous-ventriculaires sont donc des zones neurogénitrices

 

 

Protocole pour la mise en culture de cellules souches neurales

 

 

RatWistar3j.jpg

Raton de 3 jours (race Wistar)

InterpCoupesCerveauRat.jpg
  La zone sous-ventriculaire (SVZ en anglais) est située
en bordure des ventricules latéraux

 

 

 

 

LameRasoir.jpg CoupesCervDissec.jpg
Les encéphales sont prélevés sur des rats âgés de 2 à 5 jours, puis placés dans du milieu de dissection. Les méninges sont ôtées à l’aide de pinces sous contrôle de la loupe binoculaire.
Des coupes frontales sont réalisées à l’aide d’une lame de rasoir.

La zone sous-ventriculaire est extraite à l’aide de pinces fines à partir des coupes baignant dans le milieu de dissection.

SVZependorf.jpg SVZdissociation.jpg
Les fragments de SVZ sont placés dans des tubes Eppendorf.
Ils sont dissociés pendant 10 minutes à 37°C dans une solution de trypsine à 0/025% et d’EDTA à 0,265mM. La réaction enzymatique est arrêtée par ajout de sérum de veau foetal.

 La dissociation est poursuivie de façon mécanique à l’aide d’aspirations/reflux du contenu du tube Eppendorf à travers une seringue équipée d’une aiguille de 25G.

 



Après détermination de la concentration cellulaire sur cellule de Malassez, les cellules sont mises en culture à une densité de 3000 cellules/cm2 (densité couramment utilisée pour obtenir des colonies clonales de cellules ou neurosphères. Les milieux de culture sont renouvelés une fois par semaine. Les neurosphères obtenues après 10 jours de culture, en étuve à 37°C et atmosphère humide à 5% de CO2, sont appelées sphères primaires. Elles peuvent être repiquées pour obtenir des sphères secondaires (centrifugation, dissociation en présence de EGF -epithelial growth factor-et remise en culture).

 

 

Identification de futurs neurones dans les neuropshères

 

 

 

CulturCellSoucheNCam_R.jpg SchemaMarquageNCAM.jpg

 Cliquer sur l'image pour voir un agrandissement

Au sein des cultures cellulaires dérivant des SVZ, les futurs neurones sont marquées en noir (révélation de la PSA-NCAM)

Méthode d'immunomarquage des neurones par révélation de la protéine PSA-NCAM, molécule d'adhésion neuronale (NCAM = Neural Cell Adhesion Molecule)

 

 

MarquagePSANCAMcoronas_R.jpg

Marquage des futurs neurones par immunofluorescence de la protéine PSA-NCAM
Voir l'image en grande taille

 

Autres images: neurosphères d'origine tumorale


Remerciements à Laure Coulombel  (U421, Créteil, projet INSERM: cellules souches neurales dans la maladie de parkinson et dans la sclérose en plaques)

 

 

NeurosOeilNu_R.jpg NeurosTumHum_R.jpg
 Vue à l'oeil nu des neurosphères (petites billes blanches) se formant à partir des cellules tumorales. Ces neurosphères se décollent facilement du fond de la bôite.  Neurosphères vues au microscope. Les cellules souches tumorales se multiplient en formant de petits amas, d'aspect très différent des cellules stromales (en bas à droite).