Une thérapie génique utilisant le système CRISPR-Cas9
Données et questionnements. Sixième partie
Principe d’une thérapie génique utilisant le système CRISPR-Cas9
Introduction (document 1)
Les essais de thérapie génique appliquée à la maladie de Steinert (DM1) reposent sur la connaissance de la nature et de la localisation des mutations du gène DMPK. Les mutations pathologiques de ce gène sont situées dans la région 3’UTR non codante. La séquence de cette région est caractérisée par la présence d’une répétition du triplet CTG. Les allèles du gène DMPK dont le nombre de répétitions CTG est supérieur à 50 génèrent les symptômes de la maladie DM1 et ceux-ci sont d’autant plus accusés que le nombre de répétitions est élevé.
De cela découle l’idée d’une thérapie génique ayant pour objetif de modifier le génome des cellules en supprimant les expansions CTG pathologiques du gène DMPK grâce à un nouveau système d’édition génique intitulé CRISPR-Cas9. La figure 1 schématise globalement le principe de cette thérapie.
Figure 1 : principe de la thérapie.
Source : Time-controlled and muscle-specific CRISPR/Cas9-mediated deletion of CTG-repeat expansion in the DMPK gene. Beatrice Cardinali et al. Nucleic Acids. Volume 27, P184-199, March 08, 2022
Les acteurs du système CRISPR-Cas9 (Figure 2)
Ce système d’édition génique (ou génomique) comprend 3 acteurs essentiels : l’enzyme Cas9 ; l’ARN guide (Sg ARN ou g ARN), et les séquences PAM.
La figure 2 présente ces composants du systèmes en action au sein d’une cellule.
Fig2: les acteurs du système CRISPR-Cas9. La partie en bleu : région de 20 nucléotides de l’ARN guide.
Source : Simulate the Molecular Mechanism of Cas9 DNA Cleavage.
Les fonctions de ces trois acteurs sont les suivantes
- Cas9 est une enzyme d’origine bactérienne qui a pour fonction de couper les deux brins d’une séquence d’ADN en un endroit précis. C’est une nucléase. Elle n’est active qu’en association avec l’ARN guide.
- L’ARN guide (Sg ARN ou gARN) synthétisé en laboratoire, est une séquence de 100 nucléotides environ qui comprend deux régions (fig 2, à droite) : une séquence de 20 nucléotides (en bleu) qui se lie avec une séquence du gène à modifier ; la deuxième région a une structure en boucle (épingle à cheveux). Elle est reconnue par Cas9. Par elle, l’ARN guide se lie à Cas9 : formation du complexe Cas9-Sg ARN. C’est ce complexe qui agit par la suite sur l’ADN cible qu’on veut modifier.
- La séquence PAM est une courte séquence de 3 nucléotides d’un brin de l’ADN cible. Cette séquence est NGG, N désignant n’importe lequel des 4 nucléotides de l’ADN. Il existe donc de multiples séquences PAM dans la séquence d’un gène. Lorsque Cas9 du complexe Cas9-ARN guide reconnait une séquence PAM, elle provoque la séparation des deux brins de l’ARN cible à cet endroit (figure 2).
Les séquences du guide ARN et de l’ADN cible (document 3)
Immédiatement après avoir reconnu une séquence PAM, Cas9 entraîne l’ouverture de la double hélice de la séquence ciblée ce qui permet la mise en place de la première région de l’ARN guide sur la séquence ciblée (figure 3).
Fig 3 : ADN cible et ARN guide.
Source : Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols
Rechercher sur cette figure la séquence PAM et la situer par rapport à « l’ouverture de la séquence cible. Repérer les triangles rouges qui signalent la coupure de la séquence cible par Cas9.
Les étapes de l’action de CRISPR-Cas9 (document 4)
Fig 4 - Dans cette figure, les étapes sont présentées suivant leur ordre chronologique.
Source : Simulate the Molecular Mechanism of Cas9 DNA Cleavage
Questionnement
1 - Dans la figure 1, comparer les séquences, DMPK gene editing et edited gene ; Quelle information est fournie par : Decrease of CUG-foci
2 - Légendez la figure 5.
Fig 5 : les principaux acteurs en action.
Source : Nanoparticle Delivery of CRISPR/Cas9 for Genome Editing. Li Duan et al. Front. Genet., 12 May 2021. Sec. Genomic Assay Technology. Volume 12 - 2021
Source : Genome Editing Using CRISPR/Cas9
3 - Comparer les séquences de l’ADN cible et de l’ARN guide, là où elles sont appariées. Les qualifier à cet endroit.
4 - Légender la figure 4 en précisant le ou les phénomènes ayant lieu à chaque étape
5 - L’enzyme Cas9 coupe-t-elle l’ADN cible à un endroit qui lui est spécifique ?
6 - Justifier le qualificatif de « guide » pour l’ARN.
Exploitation pédagogique
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