Les caractéristiques du gène thérapeutique
Les caractéristiques du gène thérapeutique
Pour les dégager, on dispose :
- Des séquences de référence du CDS et de la dystrophine ;
- Des séquences du CDS du gène thérapeutique et de la dystrophine qu’il code ;
Fichier : Séquences DMD - Généthon.edi
- De deux schémas de la structure du gène DMD qui se recoupent et se complètent. Ils renseignent sur le nombre de nucléotides (nombre de pb) de chacun des 79 exons et sur les exons qui contribuent aux différents domaines de la dystrophine ;
Source : e-dystrophin database. The gene.
- De la figure sur la structure complète de la dystrophine et donc sur les différents domaines.
Source : e-dystrophin database. Structural domains.
- De la banque de données : The DMD mutations database. The dystrophin gene. qui donne la composition exacte de tous les exons.
Source : The DMD mutations database. The dystrophin gene
1 - Longueur du CDS du gène thérapeutique en nucléotides
La comparaison de la séquence CDS du gène thérapeutique avec celle du gène de référence montre que le CDS thérapeutique ne fait que 3435 nucléotides contre 11055 pour celle du CDS de référence. Le CDS thérapeutique est donc considérablement réduit ce qui permet sa prise en charge par un vecteur rAAV.
La comparaison montre aussi que le CDS thérapeutique possède une première partie commune avec celle de référence qui va du nucléotide 1 au nucléotide 2151. Ensuite, le CDS thérapeutique ne possède pas les nucléotides allant du 2152 au nucléotide 8796. On trouve après une autre séquence commune allant du nucléotide 8797 au nucléotide 10081.
La séquence 10081-11055 présente dans le CDS de référence est absente du CDS thérapeutique. Au total, les chercheurs en sélectionnant deux séquence du CDS de référence n’ont pas pris en compte 7620 nucléotides.
2 - Longueur en nombre d’acides aminés de la dystrophine thérapeutique
On peut traduire la séquence du CDS thérapeutique : on obtient une dystrophine thérapeutique de 1145 acides aminés considérablement raccourcie par rapport à la dystrophine de référence de 3685 acides aminés (d’où le nom de microdystrophine).
Ce que révèle aussi la traduction est que les séquences non prises en compte (ce qui correspond à des délétions) ne changent pas le cadre de lecture : le CDS du gène thérapeutique est traduit du début à la fin. Ainsi tous les exons sélectionnés sont traduits.
3 - Domaines présents et absents de la microdystrophine thérapeutique
La première partie commune aux CDS de référence et thérapeutique comprend 2151 nucléotides ce qui code pour une séquence protéique de 717 acides aminés.
Alignement avec Géniegen 2.
Il faut donc trouver les domaines de la dystrophine ayant cette longueur. Pour cela on utilise les indications sur les exons et les domaines fournis par les schémas sur la structure du gène DMD. Dans chaque exon est indiqué le nombre de nucléotides. On arrive ainsi à la conclusion que cette première partie de la microdystrophine correspond à l’ensemble : ABD-H1-R1-R2-R3-H2.
Ensuite, la longue séquence présente dans la dystrophine mais absente dans la microdystrophine doit correspondre au long domaine central « rod » à partir du R4.
Il faut déterminer à quels domaines correspond la seconde partie de la séquence de la microdystrophine. Il est logique de penser qu’elle est formée par les domaines qui assurent la liaison avec le complexe de protéines membranaires puisque pour être fonctionnelle la micordystrophine doit assurer la liaison avec la matrice extracellulaire via le complexe de protéines membranaires (dystroglycanes, sarcoglycanes). Cela doit correspondre à l’ensemble R24-H4-CRD (cystein rich domain).
Source : e-dystrophin database. Structural domains.
La base de données sur la dystrophine indique la composition du début et de la fin de chacun des 24 " rod ". Ce qui permet de déterminer très exactement la composition des séquences thérapeutiques.
La comparaison de la séquence de la microdystrophine avec celle de la dystrophine indique que la deuxième partie de la microdystrophine débute à l’acide aminé 2933 (Leu) de la dystrophine et se termine à l’acide aminé 3360 (Cys). Cela fait une séquence de 428 acides aminés.
Début de la deuxième partie de la microdystrophine. Alignement avec Géniegen 2.
Fin de la deuxième partie de la microdystrophine. Alignement avec Géniegen 2.
En utilisant les données sur la structure du gène DMD, on peut calculer le nombre de nucléotides et de là d’acides aminés de l’ensemble R24-H4-CRD. On trouve une longueur très voisine de celle tirée de la comparaison des séquences. Cela indique que cet ensemble de domaines a été retenu par les chercheur lors de la construction du gène thérapeutique.
En conclusion, on peut dire que le gène de la mirodystrophine a été construit avec les parties du gène DMD utiles pour que la protéine produite soit fonctionnelle et pour cela se lie aux protéines du complexe membranaire de la sarcolemme et à l’actine du cytosquelette.
Dans le Journal of neuromuscular diseases N. Elangkovan et George Dickson, lequel a contribué à la thérapie du Généthon, ont publié un article où ils schématisent la structure de la microdystrophine du Généthon.
Source: Nertiyan Elangkovan and George Dickson. Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. J Neuromuscul Dis. 2021.