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1. Caractérisation des cellules de la moelle osseuse 1.1. Caractérisation microscopique 1.2. Caractérisation cytométrique 1.2.1. Les cellules différenciées de la moelle osseuse 1.2.3. Les lymphocytes B, les granulocytes et les monocytes 1.2.5. Les cellules souches dans les cellules de la moelle osseuse 2. Différenciation lymphocytaire des cellules de sang de cordon en culture sur cellules stromales. Les cellules souches adultes sont des cellules rares que l'on peut observer dans différents tissus (Moelle osseuse, foie, muscles, pancréas...). La moelle osseuse est un tissu facilement accessible au sein duquel on peut trouver les cellules souches hématopoïtiques et mésenchymateuses. L'observation microscopique d'un frottis de moelle osseuse permet de déterminer la présence de différentes cellules différenciées. Figure 1. Frottis de moelle osseuse. Les flèches indiquent les mégacaryocytes (source LABORATOIRE D'HEMATOLOGIE DU C.H.U. D'ANGERS) 
L'analyse des données cytométrique est faite avec le logiciel logiciel WinMDI
Une des particularité des cellules différenciées est de présenter à leur surface des marqueurs spécifiques (CD : "Cluster of Differenciation") qui peuvent être utilisés comme antigènes pour des anticorps auxquels on aura fixé différentes molécules fluorescentes (fluorochromes). L'analyse des résultats par cytofluorométrie permet de visualiser les différentes populations cellulaires différenciées de la moelle osseuse. Figure 6. Les paramètres FSC (Forward scatter) et SSC (Side scatter) donnent des indications sur la taille et la granulosité des cellules.  Sur ce graphique bidimensionnel (Dot Plot) apparait des regroupements de cellules. Ces ensembles correspondent-ils à des groupes homogènes de cellules différenciées? L'analyse des marqueurs cellulaires devrait permettre de répondre à cette question. L'ensemble des lymphocytes T présentent à leur surface le CD3 (composant du complexe du récepteur T . Les lymphocytes T sont subdivisés en deux sous-populations:
On localise et quantifie ainsi sur le graphique bidimensionnel présentant la taille et la granulosité, les différentes populations de Lymphocytes T. On obtient une population de lymphocytes T dans la moelle osseuse de l'ordre de 7 % de la population cellulaire totale. Les lymphocytes T4 quant à eux représentent 2.5% et les lymphocytes T8 3.5%. Les lymphocytes B présentent entre autre, à leur surface le marqueur de différenciation CD19. Les ganulocytes et les monocytes partagent quant à eux le marqueur de différenciation CD11b. On localise cytométriquement et on quantifie ainsi les deux populations cellulaires qui représentent respectivement près de 50% des cellules de la moelle osseuse pour les granulocytes et les monocytes et seulement 1.23% pour les lymphocytes B. Les érythroblastes qui sont les futurs globules rouges, sont caractérisés par la présence à leur surface de la glycophorine A (GPA). On localise cytométriquement et on quantifie ainsi les érythroblastes parmi les cellules de la moelle osseuse. Les érythroblastes représentent environ 20% des cellules de la moelle osseuse. En conclusion on peut localiser sur un graphe bidimensionnel différentes populations cellulaires de la moelle osseuse. La caractérisation des cellules souches hématopoïétiques ne peut se faire à partir de la simple observation microscopique d'un frottis de moelle osseuse. Cette caractérisation nécessite une analyse des marqueurs cellulaires par cytofluorométrie. La caractérisation des cellules souches dans la moelle osseuse se fait en isolant tout d'abord les cellules indifférenciées (CD34+) puis parmi cette population cellulaires , on isole les CD38- représentant les cellules souches. La proportion de cellules indifférenciées parmi les cellules de moelle osseuse est de 1.45%. La proportion de cellules souches hématopoétiques est elle de 0.39 %. Les cellules issues du sang de cordon humain sont mis en culture sur des cellules stromales murines. Des prélèvement sont réalisés à différentes étapes de la différenciation lymphocytaire. Les marqueurs cellulaires caractérisés (CD79a marqueur précoce de la différenciation et CD19 marqueur final de différenciation) permettent de suivre cette différenciation dans le temps. Pour chaque fichier de données cytométriques on a marqué
on observe sur cette cinétique une évolution des populations cellulaires. En effet , la population cellulaire CD34+,CD19-,CD79- diminue au cours du temps, alors que les cellules présentent progressivement des caractéres de cellules différenciées (CD79 puis CD19 pour les lymphocytes B différenciés. Cette différenciation est directement liée au contact établi entre les cellules indifférenciées issues du sang de cordon avec les cellules stromales . |
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