Expérience de Büchner

Expérience dite de Büchner
 

Publiée par Büchner en 1897, une expérience reposant sur les mêmes principes avait été présentée dès 1845 à un congrès de vignerons. Elle consiste à préparer un extrait acellulaire soluble de levures et à le mettre en présence de glucose. L'apparition d'alcool dans le milieu révèle l'activité fermentaire. On peut également la révéler par la production de dioxyde de carbone, ce qui est le cas dans le protocole ci-dessous.

Objectifs :
Montrer qu'une activité biologique, la fermentation alcoolique, peut se dérouler in vitro, en solution, en l'absence de tout organisme vivant (milieu acellulaire).
Les cellules obéissent aux lois de la chimie.

Protocole
1- Mettre en suspension 20 g de Levure dans 100 mL de milieu complet et mettre en agitation lente pendant quelques heures sur agitateur magnétique.
 

2- Centrifuger les cellules et remettre le culot en suspension dans 25 mL d'eau distillée sortie du réfrigérateur. Agiter longuement pour bien remettre les cellules en suspension.
 

3- Centrifuger de nouveau et remettre le culot en suspension dans l'eau froide. Recommencer la même opération jusqu’à ce que le surnageant soit parfaitement limpide. 
 

4- Remettre le culot en suspension et filtrer sur un papier filtre épais.
 

5- Faire gicler de l'alcool absolu froid (sorti du réfrigérateur) dans le filtre avec une pipette Pasteur munie d’une tétine pour mettre les levures en suspension dans l'alcool absolu et laisser filtrer. 
 

6- Recommencer la même opération une deuxième fois (renouveler si le filtrat n’est pas limpide).
 

7- Faire sécher le filtre à l'étuve à 35°C et broyer très soigneusement le résidu sec de levure dans un mortier avec une petite quantité de sable lavé à l'acide et une pincée de carbonate de calcium. 
 

8- Ajouter 25 mL de tampon phosphate pH 5,6 et continuer à broyer. 
 

9- Centrifuger et récupérer le surnageant.
 

10- Placer le surnageant dans un microrespiromètre et y dissoudre 1 g de glucose. Dans la cuve de compensation disposer un volume équivalent d’eau contenant 1 g de glucose et mesurer le dégagement gazeux.

Milieu complet

 Bactopeptone .....................10 g
 Extrait de levures..................10 g
 Glucose ................................20 g
 Tampon phosphate pH 5,6.......1 L

Tampon phosphate pH 5,6

1 : Solution d'hydrogénophosphate disodique anhydre à 9,46 g/L
 

2 : Solution de dihydrogénophosphate monopotassique à 9,06 g/L
Mélanger 50 mL de solution 1 avec 950 mL de solution 2.