Activité 1- Biodiversité cultivable du sol

Les précautions sanitaires

La manipulation d'un sol en classe ne comporte pas plus de danger qu'une activité de jardinage ou de nettoyage de chaussures après une promenade en forêt.

Les risques potentiels de cette manipulation se posent une fois la culture réalisée. Certains germes pathogènes, naturellement peu présents dans le sol, peuvent être sélectionnés et multipliés lors de cette culture. Afin d'éviter toute contamination, il est indispensable:

• de fermer hermétiquement les boîtes de Pétri (avec un film de type "parafilm" préservant les échanges gazeux) dès la mise en culture
• de ne jamais ouvrir une boîte ensemencée,
• de détruire à l'autoclave les boîtes après observation.

Texte réglementaire (à partir du BO n°43 du 22/10/1973)

Les précautions scientifiques

Ces remarques scientifiques sont issues d'un entretien avec Madame Claire Chenu (Professeure de Sciences du Sol à l’AgroParisTech ex. Institut National Agronomique Paris-Grignon) Grignon le 23 Janvier 2007.

Le protocole suivant permettra de comparer la diversité des microorganismes cultivables de différents sols. Claire Chenu insiste sur le fait que cette diversité  n'est pas représentative de la diversité globale en microorganismes dans un sol. Non seulement parce que de nombreux microorganismes extraits ne pourront pas se développer en culture, mais surtout parce qu'une majorité de microorganismes reste fortement liée aux particules du sol et ne peut être extraite.

Claire Chenu explique que la diversité microbienne globale n'a été que récemment révélée par des analyses de génomique : 10.000 à 15.000 génomes bactériens sont présents par gramme de sol lequel représente de fait un immense réservoir de diversité.

Claire Chenu précise que la diversité microbienne du sol n'est pas représentative de la biodiversité totale de l'écosystème auquel ce sol participe. En effet, on observe dans le sol une forte redondance fonctionnelle (beaucoup de microorganismes exerçant la même fonction écologique mais dans des conditions édaphiques différentes).

Le protocole

Objectif : Sensibiliser les élèves aux études sur la biodiversité par l’étude de la diversité des microorganismes cultivables présents dans différents échantillons de sols.

On expose ici le protocole de mise en culture. Une étude préalable du contenu en eau du sol permettrait une démarche plus rigoureuse à partir d'une même masse de matière sèche et non d’un même volume, pour différents échantillons.

Matériel nécessaire : 

 Echantillon de sol et dosette  et eau ou liquide physiologique pour la mise en suspension

Matériel de culture  : billes en verre pour étaler le prélèvement, pipettes Pasteur, boîtes de Pétri avec milieu de culture ; il peut s'agir d'un milieu complet type PDA Potato Dextrose Agar ou Sabouraud ; m. complet avec antibactérien (antibiotique), voire m. complet avec antifongique, (médicament du type Fungizone) pour apporter une démonstration plus rigoureuse que les microorganismes qui se développent dans nos conditions sont bien des champignons ; m. minimum pour détecter les autotrophes à la lumière, etc. voir ci-après les autres suggestions en annexe ; le milieu PDA est recommandé pour l'étude des champignons du sol, notre objectif principal ici.

Poste de culture en milieu stérile 

Mode opératoire :

• Homogénéiser l’échantillon en cassant les agrégats à la main . Prélever un volume précis (ex. dosette de lait maternisé, soit 10 mL) de terre (ou alternativement une même masse, p ex 1g de terre).

On travaille alors dans des conditions de stérilité, ou, comme ici, en effectuant un témoin avec le seul liquide de mise en suspension, laissé à l’air libre ;

• Verser  la terre dans un flacon de 50 mL à vis, mesurer 20 mL d’eau ou de liquide physiologique (pour éviter les chocs osmotiques) puis les ajouter à la terre.
• Homogénéiser doucement pendant 2 min en agitant par rotation  puis laisser décanter 10 min

Impérativement en conditions stériles , effectuer la mise en culture

• Distribuer dans chaque boîte une dizaine de billes en verre (en ayant soin de ne pas les laisser tomber sur la gélose d'une trop grande hauteur sinon les billes rebondissent sur la gélose et se retrouvent... par terre!).
• Prélever en surface le surnageant dans la partie claire, à l’aide d’une pipette stérile et déposer soit une goutte (dénombrement des cellules) soit 3 gouttes (tests d’activité biologique) sur le milieu de culture approprié (cf. annexe) (dépôt témoin , dépôt de l’échantillon )
• Agiter les boîtes par un mouvement horizontal circulaire, afin que les billes répartissent le prélèvement sur la gélose (on peut procéder par une série de translation en tournant successivement p ex d'un quart de tour la boîte)
• Retourner  les boites , éliminer les billes en les déposant dans un bécher, en condition stérile (ces billes sont réutilisables, cf. annexe).
• Fermer hermétiquement les boîtes à l'aide d'un ruban de type "Parafilm".
• Mettre  à incuber au moins 48h à une température constante comprise entre 20° et 30°C (boîtes retournées sur leurs couvercles).

exemple de résultats obtenus avec les élèves

Remarque : Notre propre expérience avec nos élèves montre que l'emploi de billes de verre pour les étalements donne de meilleurs résultats qu'avec les rateaux en verre ou en plastique, et en outre plus écologiques puisque l'on peut réutiliser les billes après lavage et stérilisation.

Paramètres pouvant être mesurés :

• Nombre de colonies se développant sur les différents milieux (opérer sur des colonies isolées, en notant bien la taille, morphologie, couleur, homogénéité, etc. de chaque colonie).
• Activité bactéricide : on étale sur boîtes de Pétri une bactérie dont on aura réalisé une préculture (p ex E. coli ou B. subtilis) dans des conditions qui permettent normalement d'obtenir un film continu recouvrant la totalité de la surface, et on dépose quelques gouttes d'extraits de sol (de 1 à 3 gouttes, on peut tester différents dépôts); on incube (entre 25 et 35°C) et on mesurera - en faisant un suivi sur quelques jours - les diamètres des plages de lyse.
• Activité fongicide : même principe ; on étale ici "à confluence" une levure (p ex S. cerevisiae) ; on peut aussi tester une moisissure comme Sordaria.
• Activité amylase : test sur boîte gélose + amidon (entre 0,3 et 1%) ; on mesure le diamètre du halo autour des colonies après coloration au Lugol réalisée après quelques jours de culture (photographie ci-avant) ; là où l'amidon aura été consommé, la coloration au lugol sera négative (jaune-orangée) ; on doit donc s'assurer que les boîtes ont été préparées de façon homogène (témoins non ensemencés présentant une coloration uniforme bleu sombre, montrant ainsi la répartition homogène de l'amidon en présence du colorant).
• Activité lipase : test sur boîte gélosée avec une émulsion d’huile [à mettre au point...].
• Activité protéase : test sur boîtes peptone-caséine1%, diamètre du halo autour des colonies après coloration de biuret.
• Activité mutagène : on peut ici tester l'effet mutagène des extraits préparés (extrait de sol pollué p ex) sur des souches de laboratoire dont le suivi phénotypique est assez simple ; p ex une souche de la bactérie E. coli lactose+ qui donnera une coloration bleue en présence du substrat artificiel x-gal, peut muter et devenir lactose- et être blanche en présence de x-gal ; on peut également exloiter le système des mutants d'auxotrophie pour l'adénine chez les levures S. cerevisiae ou S. pombe et rechercher "des blancs parmi des rouges", ou l'inverse, selon la configuration recherchée.

Voir le protocole en images

Protocole au format pdf